כאן אנו מדגימים כיצד להתרבות המקסיקני טטרה Astyanax מקסיקניוס, להעלות את הזחלים, ולבצע אימונוהיסטוכימיה כל הר על דגים לאחר הזחל להשוות את הפנוטיפים של נהר ומערה מותאם דגים. אנחנו מגדלים את הדגים באותה צפיפות על דיאטה עשירה בחומרים מזינים של רוטיפרים. טכניקה זו מבטיחה צמיחה עקבית ומספקת יתרונות בעלויות, אבטחה ביולוגית ואיכות מים.
כדי להתחיל, מניחים רשת פלסטיק בתחתית מיכל של חמישה גלון. ואז למלא את המיכל עם מים מוכנים דגים. מדביקים דוד מים לצד המיכל.
הוסף נקבה אחת ושני דגי אסטיאנקס מקסיקניוס זכרים בני יותר משנה למיכל. הגדר את הטמפרטורה של דוד המים ל 24 מעלות צלזיוס. לאחר 24 שעות, להגדיל את הטמפרטורה על ידי מעלות צלזיוס אחד.
להאיר פנס לתוך החלק התחתון של המיכל כל יום כדי לבדוק ביצים. לאחר שהביצים מזוהות במיכל הרבייה, מוציאים את הדגים הבוגרים ואת רשת הפלסטיק. השתמש בבקבוק כדי להפחית את עומק המים ל 10 ס"מ.
כדי להעריך את זמן ההפריה, השתמש פיפטה העברה למקם כמה ביצים לתוך צלחת פטרי ולהציג אותם עם מיקרוסקופ סטריאו כדי לקבוע את השלב שלהם. הסר ביצים אטומות או צואה. לאחר מכן ממלאים את המיכל במים מוכנים לדגים ומוסיפים למים שבע טיפות של מתילן כחול.
לאחר מכן, מוסיפים תנור ובועה אקווריום למיכל. הגדר את התנור ל 24 מעלות צלזיוס ולהתאים את הרגולטור זרם האוויר כדי לייצר זרם עדין של בועות. ואז לכסות את המיכל כדי לשמור על טמפרטורת המים.
מוסיפים 20 גרם מלח לשמונה ליטרים של מים מוכנים לדגים ומערבבים אותו עד שהוא מומס. לאחר מכן מוסיפים ליטר אחד של המים המוכנים לכל מיכל משתלה. לאחר מכן השתמש פיפטה העברה להעביר 20 של הזחלים בקעו לכל מיכל משתלה.
להתסיס את המים במיכל הגדול יותר כדי להבטיח שכל הזחלים הוסרו. כדי להכין את מזון הדגים, מוסיפים שלושה מ"ל של תערובת אצות לליטר אחד של רוטיפרים שנקטפו. חמישה ימים לאחר ההפריה מוסיפים שלושה מ"ל של מזון דגים לכל מיכל משתלה.
הרוטיפרים צריכים להיות גלויים בקבוצות צפופות בפינת המכולות אלא אם כן הם נראים ליד המרכז. בדוק את המיכל עבור rotifers כל יום ולהוסיף מזון נוסף אם הריכוז מתרוקן. הסר כל זחלים מתים.
ראשית, כדי לנקות את מערכת העיכול של תוכן המזון, יוצקים את מיכל המשתלה עם הדגים של הגיל הרצוי באמצעות מסננת רשת ניילון. מניחים את מסננת לתוך מיכל עם מים מוכנים דגים נקיים לעכב מזון במשך 24 שעות. לאחר המתת חום הדגים, על פי הנחיות המוסד, להשתמש פיפטה העברה להעביר את הדגים צינור חרוט.
החלף את פתרון המתת החסד בתיקון. ולהדיגר הצינור עם נדנדה לילה ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר את התיקון והחלף אותו ב- PBST.
דגירה הצינור במשך 15 דקות נוספות עם נדנדה. ולחזור על תהליך הכביסה עוד פעם אחת. לאחר מכן, השתמש פיפטה העברה להעביר את הדג לבקבוקון זכוכית ארבעה מ"ל עם כובע העליון בורג.
הסר את PBST מן הבקבוקון ולהוסיף שלושה מ"ל של פתרון חסימה. הדגירה את הבקבוקון בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת עם נדנדה. לאחר מכן, השתמש פיפטה העברה כדי להסיר את פתרון החסימה ולהחליף אותו עם נוגדן ראשוני מדולל פתרון חסימה.
הדגירה את הבקבוקון לילה בטמפרטורת החדר עם תסיסה. לאחר מכן, לשטוף את הדגים עם PBST שלוש פעמים, כפי שתואר קודם לכן. החלף את ה- PBST בנוגדן משני מדולל בת פתרון חסימה.
ולדגר את הבקבוקון לילה בטמפרטורת החדר עם תסיסה. לבסוף, לשטוף את הדגים שלוש פעמים במשך 15 דקות עם PBST. באמצעות פרוטוקול זה, דגי פני השטח טינה, מולינו ודג מערת פצ'ון גודלו במיכלי רבייה סטטיים.
פני השטח ופאחון הולידו, עם עוברים מופרים, תמיד ייצרו זחלים בקעו. בעוד מולינו ו Tinaja לא הצליחו חלק מהזמן. באופן כללי, דגי פני השטח ייצרו את המספר הגדול ביותר של זחלים לכל השרץ, ואחריו פצ'ון, טינז'ה ומולינו בהתאמה.
טכניקת הכשל החיסונים כולה שימשה בהצלחה לתיוג נוירונים ותאי לבלב בשלבים של עד 12.5 ימים לאחר ההפריה. חשוב להסיר כל דג מת כשאתה מרים את הזחלים ולרשום את מספר הדגים ששרדו. אם דגים רבים מתים זה יכול להיות בגלל זיהום חיידקי או פטרייתי.
יש לערפל את הטנקים עם 70% אתנול לפני השימוש. טכניקת כשל חיסוני שתיארנו שימשה בהצלחה עבור הנוגדנים המפורטים בטבלת החומרים. לאחר immunostaining, דגים יכולים להיות כל רכוב או חתך כדי להציג כל רקמה מעניינת.
בשילוב, הליך הרבייה, הבקיעה והכשלה חיסונית מספק שיטה איתנה להערכת פעילות הגנים NC2 באופן דומה בין מעבדות.
