Qui dimostriamo come allevare il messicano Tetra Astyanax Mexicanus, allevare le larve ed eseguire l'immunoistochimica a montaggio intero sui pesci post larvali per confrontare i fenotipi di pesci adattati al fiume e alle caverne. Alziamo il pesce alla stessa densità con una dieta ricca di nutrienti di rotiferi. Questa tecnica garantisce una crescita costante e offre vantaggi in termini di costi, biosicurezza e qualità dell'acqua.
Per iniziare, posizionare una rete di plastica nella parte inferiore di un serbatoio da cinque galloni. Quindi riempire il serbatoio con acqua pronta per il pesce. Apporre uno scaldabagno sul lato del serbatoio.
Aggiungi una femmina e due pesci astyanax mexicanus maschi che hanno più di un anno al serbatoio. Impostare la temperatura dello scaldabagno a 24 gradi Celsius. Dopo 24 ore, aumentare la temperatura di un grado Celsius.
Illumina una torcia elettrica sul fondo del serbatoio ogni giorno per verificare la presenza di uova. Una volta identificate le uova nel serbatoio di riproduzione, rimuovere il pesce adulto e la rete di plastica. Utilizzare un becher per ridurre la profondità dell'acqua a 10 cm.
Per stimare il tempo di fecondazione, utilizzare una pipetta di trasferimento per posizionare diverse uova in una piastra di Petri e visualizzarle con un microscopio stereo per determinarne lo stadio. Rimuovere uova o feci opache. Quindi riempire il serbatoio con acqua pronta per il pesce e aggiungere sette gocce di blu di metilene all'acqua.
Dopo questo, aggiungi un riscaldatore e un bubbler dell'acquario al serbatoio. Impostare il riscaldatore a 24 gradi Celsius e regolare il regolatore del flusso d'aria per produrre un flusso delicato di bolle. Quindi coprire il serbatoio per mantenere la temperatura dell'acqua.
Aggiungere 20 grammi di sale a otto litri di acqua pronta per il pesce e mescolarla fino a quando non viene sciolta. Quindi aggiungere un litro dell'acqua preparata a ogni contenitore del vivaio. Quindi utilizzare una pipetta di trasferimento per spostare 20 delle larve tratteggiate in ogni contenitore del vivaio.
Agitare l'acqua nel serbatoio più grande per assicurarsi che tutte le larve siano state rimosse. Per preparare il cibo per pesci, aggiungere tre ml di miscela di alghe a un litro di rotiferi raccolti. Cinque giorni dopo la fecondazione aggiungono tre ml del cibo per pesci a ciascun contenitore del vivaio.
I rotiferi devono essere visibili in gruppi densi all'angolo dei contenitori, a meno che non siano visibili vicino al centro. Controllare il contenitore per le rotifere ogni giorno e aggiungere più cibo se la concentrazione è esaurita. Rimuovere eventuali larve morte.
In primo luogo, per cancellare il tratto gastrointestinale del contenuto alimentare, versare il contenitore del vivaio con il pesce dell'età desiderata attraverso un colino a rete di nylon. Mettere il colino in un contenitore con acqua pulita pronta per il pesce e trattenere il cibo per 24 ore. Dopo aver eutanasiato il pesce, secondo le linee guida istituzionali, utilizzare una pipetta di trasferimento per trasferire il pesce in un tubo conico.
Sostituire la soluzione di eutanasia con fissante. E incubare il tubo con dondolo durante la notte a 4 gradi Celsius. Successivamente, rimuovere il fissatore e sostituirlo con PBST.
Incubare il tubo per altri 15 minuti con il dondolo. E ripeti il processo di lavaggio ancora una volta. Successivamente, utilizzare una pipetta di trasferimento per spostare il pesce su una fiala di vetro da quattro ml con un tappo superiore a vite.
Rimuovere il PBST dal flaconcino e aggiungere tre ml di soluzione di blocco. Incubare il flaconcino a temperatura ambiente per un'ora con il dondolo. Successivamente, utilizzare una pipetta di trasferimento per rimuovere la soluzione di blocco e sostituirla con anticorpi primari diluiti nella soluzione di blocco.
Incubare il flaconcino durante la notte a temperatura ambiente con agitazione. Successivamente, lavare il pesce con PBST tre volte, come descritto in precedenza. Sostituire il PBST con anticorpi secondari diluiti in soluzione di blocco.
E incubare il flaconcino durante la notte a temperatura ambiente con agitazione. Infine, lavare il pesce tre volte per 15 minuti con PBST. Utilizzando questo protocollo, i pesci di superficie Tinaja, Molino e Pachon sono stati allevati in serbatoi di riproduzione statici.
La superficie e pachon si generano, con embrioni fecondati, hanno sempre prodotto larve tratteggiate. Mentre i Molino e i Tinaja non ebbero successo. In generale, i pesci di superficie producevano il maggior numero di larve per deposizione delle uova, seguiti rispettivamente da Pachon, Tinaja e Molino.
La tecnica di immunostaining a montaggio intero è stata utilizzata con successo per etichettare neuroni e cellule pancreatiche in fasi fino a 12,5 giorni dopo la fecondazione. È importante rimuovere qualsiasi pesce morto mentre alleva le larve e registri il numero di pesci sopravvissuti. Se molti pesci muoiono può essere dovuto a contaminazione batterica o fungina.
I serbatoi devono essere sterilizzati con il 70% di etanolo prima dell'uso. La tecnica di immunostaining che abbiamo descritto è stata utilizzata con successo per gli anticorpi elencati nella tabella dei materiali. Dopo l'immunosocienza, i pesci possono essere montati interi o se vengono se vengono se vengono netti per visualizzare qualsiasi tessuto di interesse.
In combinazione, la procedura di allevamento, schiusa e immunosocienza fornisce un metodo robusto per valutare l'attività genica NC2 in modo comparabile tra i laboratori.
