Ici, nous démontrons comment élever le Mexicain Tetra Astyanax Mexicanus, élever les larves, et effectuer l’immunohistochimie de montage entier sur les poissons post-larvaires pour comparer les phénotypes des poissons adaptés aux rivières et aux grottes. Nous élevons les poissons à la même densité sur un régime riche en nutriments de rotifères. Cette technique assure une croissance constante et offre des avantages en termes de coût, de biosécurité et de qualité de l’eau.
Pour commencer, placez un maillage en plastique au fond d’un réservoir de cinq gallons. Remplissez ensuite le réservoir d’eau prête pour le poisson. Apposer un chauffe-eau sur le côté du réservoir.
Ajouter une femelle et deux poissons mâles Astyanax Mexicanus qui ont plus d’un an dans le réservoir. Réglez la température du chauffe-eau à 24 degrés Celsius. Après 24 heures, augmenter la température d’un degré Celsius.
Faites briller une lampe de poche dans le fond du réservoir tous les jours pour vérifier s’il y a des œufs. Une fois que les œufs sont identifiés dans le réservoir de reproduction, retirez le poisson adulte et le maillage en plastique. Utilisez un bécher pour réduire la profondeur de l’eau à 10 cm.
Pour estimer l’heure de la fécondation, utilisez une pipette de transfert pour placer plusieurs œufs dans une boîte de Pétri et les voir avec un microscope stéréo pour déterminer leur stade. Retirer les œufs ou les excréments opaques. Remplissez ensuite le réservoir d’eau prête pour le poisson et ajoutez sept gouttes de bleu méthylène à l’eau.
Après cela, ajouter un chauffe-eau et un bubbler aquarium au réservoir. Réglez le chauffe-eau à 24 degrés Celsius et ajustez le régulateur du flux d’air pour produire un léger flux de bulles. Couvrez ensuite le réservoir pour maintenir la température de l’eau.
Ajouter 20 grammes de sel à huit litres d’eau prête à l’eau et remuer jusqu’à ce qu’il soit dissous. Ajouter ensuite un litre d’eau préparée à chaque contenant de pépinière. Ensuite, utilisez une pipette de transfert pour déplacer 20 des larves écloses vers chaque récipient de pépinière.
Agiter l’eau dans le réservoir plus grand pour s’assurer que toutes les larves ont été enlevées. Pour préparer les aliments pour poissons, ajouter trois ml de mélange d’algues à un litre de rotifères récoltés. Cinq jours après la fécondation, ajouter trois ml de nourriture pour poissons à chaque contenant de pépinière.
Les rotifères doivent être visibles en groupes denses à l’angle des conteneurs à moins d’être visibles près du centre. Vérifiez le contenant pour les rotifères tous les jours et ajoutez plus de nourriture si la concentration est épuisée. Enlevez les larves mortes.
Tout d’abord, pour dégager le tractus gastro-intestinal du contenu alimentaire, versez le récipient de pépinière avec le poisson de l’âge désiré à travers une passoire en maille de nylon. Placer la passoire dans un récipient avec de l’eau propre prête pour le poisson et retenir les aliments pendant 24 heures. Après avoir euthanasié le poisson, selon les directives institutionnelles, utiliser une pipette de transfert pour transférer le poisson dans un tube conique.
Remplacez la solution d’euthanasie par fixative. Et incuber le tube avec bascule pendant la nuit à 4 degrés Celsius. Après cela, retirez le fixatif et remplacez-le par PBST.
Incuber le tube pendant encore 15 minutes avec le basculement. Et répétez le processus de lavage une fois de plus. Ensuite, utilisez une pipette de transfert pour déplacer le poisson sur un flacon de verre de quatre ml avec un bouchon de vis.
Retirez le PBST du flacon et ajoutez trois ml de solution de blocage. Incuber le flacon à température ambiante pendant une heure avec le basculement. Après cela, utilisez une pipette de transfert pour enlever la solution de blocage et la remplacer par un anticorps primaire dilué dans la solution de blocage.
Incuber le flacon toute la nuit à température ambiante avec agitation. Ensuite, lavez le poisson avec PBST trois fois, comme décrit précédemment. Remplacez le PBST par un anticorps secondaire dilué dans la solution de blocage.
Et incuber le flacon toute la nuit à température ambiante avec agitation. Enfin, laver le poisson trois fois pendant 15 minutes avec le PBST. En utilisant ce protocole, les poissons de surface Tinaja, Molino et Pachon poissons des cavernes ont été élevés dans des réservoirs de reproduction statique.
La surface et Pachon fraye, avec des embryons fécondés, produisent toujours des larves écloses. Alors que les Molino et Tinaja ont échoué une partie du temps. En général, les poissons de surface produisaient le plus grand nombre de larves par frai, suivis respectivement de Pachon, Tinaja et Molino.
La technique d’immunostaining de montage entier a été avec succès employée pour étiqueter des neurones et des cellules pancréatiques aux étapes jusqu’à 12.5 jours après fertilisation. Il est important d’enlever les poissons morts lorsque vous élevez les larves et enregistrez le nombre de poissons survivants. Si de nombreux poissons meurent, cela peut être dû à une contamination bactérienne ou fongique.
Les réservoirs doivent être stérilisés avec 70 % d’éthanol avant utilisation. La technique d’immunostaining que nous avons décrite a été avec succès employée pour les anticorps énumérés dans le tableau de matériaux. Après immunostaining, le poisson peut être monté entier ou sectionné pour voir n’importe quel tissu d’intérêt.
En combinaison, la procédure de reproduction, d’éclosion et d’immunostaining fournit une méthode robuste pour évaluer l’activité génétique NC2 d’une manière comparable entre les laboratoires.
