Burada, Meksika Tetra Astyanax Mexicanus'un nasıl yetiştirilebileceğimizi, larvaları nasıl yetiştirebileceğimizi ve nehir ve mağaraya uyarlanmış balıkların fenomenilerini karşılaştırmak için post larva balıklarında tam bir immünohistokimya yınasıl gerçekleştirebileceğimizi gösteriyoruz. Biz rotifers bir besin açısından zengin diyet aynı yoğunlukta balık yükseltmek. Bu teknik tutarlı büyüme sağlar ve maliyet, biyogüvenlik ve su kalitesi nde avantajlar sağlar.
Başlamak için, beş galon tankın altına plastik bir örgü yerleştirin. Sonra balık hazır su ile tank doldurun. Tankın yan tarafına bir su ısıtıcısı yapıştırın.
Tanka bir yaşından büyük olan bir dişi ve iki erkek Astyanax Mexicanus balığı ekleyin. Su ısıtıcısının sıcaklığını 24 dereceye ayarlayın. 24 saat sonra, sıcaklığı bir derece santigrat artırın.
Yumurta ları kontrol etmek için her gün tankın dibine bir el feneri parlayın. Yumurtalar üreme tankında tanımlandıktan sonra, yetişkin balıkları ve plastik kafesi çıkarın. 10 cm su derinliğini azaltmak için bir beher kullanın.
Döllenme süresini tahmin etmek için, bir petri kabına birkaç yumurta yerleştirmek ve evrelerini belirlemek için stereo mikroskopla görüntülemek için bir transfer pipetkullanın. Opak yumurta veya dışkı çıkarın. Sonra balık hazır su ile tank doldurun ve suya metilen maviyedi damla ekleyin.
Bundan sonra, tanka bir ısıtıcı ve akvaryum kabarcık ekleyin. Isıtıcıyı 24 santigrat dereceye ayarlayın ve hava akımı regülatöründen hafif bir kabarcık akışı oluşturmak için ayarlayın. Daha sonra su sıcaklığını korumak için tankı kapatın.
Sekiz litre balık hazır suya 20 gram tuz ekleyin ve eriyene kadar karıştırın. Sonra her kreş konteyner için hazırlanan su bir litre ekleyin. Daha sonra her bir fidanlık konteyner için yumurtadan larva 20 taşımak için bir transfer pipet kullanın.
Tüm larvaların çıkarıldığından emin olmak için büyük tanktaki suyu boşaltın. Balık gıda hazırlamak için, hasat rotifers bir litre yosun karışımı üç ml ekleyin. Beş gün sonra döllenme her kreş konteyner için balık gıda üç ml ekleyin.
Rotifers merkezi yakınında görünür sürece konteyner köşesinde yoğun gruplar halinde görünür olmalıdır. Her gün rotifers için konteyner kontrol edin ve konsantrasyon tükenmiş ise daha fazla gıda ekleyin. Ölü larvaları çıkarın.
İlk olarak, gıda içeriğinin gastrointestinal sistem temizlemek için, bir naylon örgü süzgeç ile istenilen yaş balık ile kreş konteyner dökün. Temiz balık hazır su ile bir kap içine süzgeç yerleştirin ve 24 saat boyunca yiyecek tutun. Balık ötenazi sonra, kurumsal kurallara göre, konik bir tüp balık aktarmak için bir transfer pipet kullanın.
Ötenazi çözeltisini fiksatif ile değiştirin. Ve tüpü bir gecede 4 derece santigrat derecede sallayarak kuluçkaya yatırın. Bundan sonra fiksatif içıkarın ve PBST ile değiştirin.
Tüpü 15 dakika daha sallayarak kuluçkaya yatırın. Yıkama işlemini bir kez daha tekrarlayın. Daha sonra, bir vida üst kapağı ile dört ml cam şişe balık taşımak için bir transfer pipet kullanın.
PBST'yi şişeden çıkarın ve üç ml bloklama çözeltisi ekleyin. Şişeyi oda sıcaklığında bir saat boyunca sallayarak kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, engelleme çözeltisini çıkarmak için bir transfer pipeti kullanın ve bloklama çözeltisinde seyreltilmiş birincil antikor ile değiştirin.
Tüplü olarak gece boyunca şişeyi oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Daha sonra, daha önce açıklandığı gibi, PBST ile üç kez balık yıkayın. PBST'yi bloklama çözeltisinde seyreltilmiş ikincil antikorile değiştirin.
Ve şişeyi gece boyunca oda sıcaklığında ajitasyonla kuluçkaya yatırın. Son olarak, PBST ile 15 dakika boyunca üç kez balık yıkayın. Bu protokol kullanılarak, yüzey balıkları Tinaja, Molino ve Pachon mağara balıkları statik üreme tanklarında yetiştirildi.
Yüzey ve Pachon, döllenmiş embriyolar ile, her zaman yumurtadan larvaüretti. Molino ve Tinaja bazı zaman başarısız oldu. Genel olarak, yüzey balıkları yumurtlama başına en fazla larva üretti ve onu sırasıyla Pachon, Tinaja ve Molino izledi.
Tüm montaj immünboyama tekniği başarıyla 12.5 gün sonrası döllenme aşamaları nöronlar ve pankreas hücreleri etiketlemek için kullanılmıştır. Larvaları yükseltirken ve hayatta kalan balıkların sayısını kaydederken ölü balıkları çıkarmak önemlidir. Birçok balık ölürse bakteriyel veya mantar kontaminasyonu nedeniyle olabilir.
Tanklar kullanılmadan önce %70 etanol ile sterilize edilmelidir. Tarif ettiğimiz immünboyama tekniği malzeme tablosunda listelenen antikorlar için başarıyla kullanılmıştır. Immunostaining sonra, balık bütün monte edilebilir veya ilgi herhangi bir doku görüntülemek için kesitli.
Birlikte, Üreme, kuluçka ve immünboyama prosedürü laboratuvarlar arasında karşılaştırılabilir bir şekilde gen aktivitesi NC2 değerlendirmek için sağlam bir yöntem sağlar.
