Здесь мы демонстрируем, как разводить мексиканскую Tetra Astyanax Mexicanus, поднимать личинки и выполнять цельно-монтажную иммуногистохимию на постлитровой рыбе, чтобы сравнить фенотипы речной и пещерной приспособленной рыбы. Мы поднимаем рыбу с той же плотностью на богатую питательными веществами диету ротиферов. Этот метод обеспечивает постоянный рост и обеспечивает преимущества в стоимости, биобезопасности и качестве воды.
Для начала поместите пластиковую сетку на дно пятигаллонной цистерны. Затем заполните бак с рыбой готовой водой. Прикрепите водонагреватель к стороне бака.
Добавьте одну самку и двух самцов рыбы Astyanax Mexicanus, которые более одного года в бак. Установите температуру водонагревателя до 24 градусов по Цельсию. Через 24 часа увеличьте температуру на один градус цельсия.
Блеск фонарик в нижней части бака каждый день, чтобы проверить на яйца. После того, как яйца определены в племенной бак, удалить взрослую рыбу и пластиковую сетку. Используйте стакан, чтобы уменьшить глубину воды до 10 см.
Чтобы оценить время оплодотворения, используйте перенесите пипетки, чтобы поместить несколько яиц в чашку Петри и просмотреть их с помощью стерео микроскопа, чтобы определить их стадию. Удалите непрозрачные яйца или фекалии. Затем заполните бак с рыбой готовой водой и добавить семь капель метиленового синего в воду.
После этого добавьте в бак обогреватель и аквариумный пузырь. Установите обогреватель до 24 градусов по Цельсию и отрегулируйте регулятор воздушного потока, чтобы произвести нежный поток пузырьков. Затем накройте бак для поддержания температуры воды.
Добавьте 20 граммов соли в восемь литров готовой воды и перемешайте, пока она не растворит. Затем добавьте один литр подготовленной воды в каждый контейнер питомника. Далее используйте перенесите пипетку для перемещения 20 вылупившихся личинок в каждый контейнер питомника.
Агитировать воду в большем баке, чтобы убедиться, что все личинки были удалены. Чтобы приготовить рыбную пищу, добавьте три мл смеси водорослей в один литр собранных ротиферов. Через пять дней после оплодотворения добавить три мл рыбной пищи в каждый контейнер питомника.
Ротиферы должны быть видны в плотных группах на углу контейнеров, если не видны вблизи центра. Проверьте контейнер для ротиферов каждый день и добавить больше пищи, если концентрация исчерпана. Удалите мертвых личинок.
Во-первых, чтобы очистить желудочно-кишечный тракт от пищевого содержимого, залить питомник контейнер с рыбой желаемого возраста через нейлоновую сетку ситечко. Поместите ситечко в контейнер с чистой рыбой готовой водой и удерживать пищу в течение 24 часов. После усыпления рыбы, в соответствии с институциональными руководящими принципами, использовать передачу пипетки для передачи рыбы в коническую трубку.
Замените решение эвтаназии на фиксативное. И инкубировать трубку с качания ночь при 4 градусах по Цельсию. После этого снимите фиксатор и замените его на PBST.
Инкубировать трубку в течение еще 15 минут с качания. И повторите процесс мытья еще раз. Затем используйте трубу для переноса рыбы на стеклянный флакон из четырех мл с крышкой винта.
Удалите PBST из флакона и добавьте три мл блокирующего раствора. Инкубировать флакон при комнатной температуре в течение одного часа с качания. После этого используйте перенесите пипетки, чтобы удалить блокирующий раствор и заменить его первичным антителом, разбавленным блокирующим раствором.
Инкубировать флакон на ночь при комнатной температуре с возбуждением. Далее, мыть рыбу с PBST три раза, как описано ранее. Замените PBST вторичным антителом, разбавленным блокирующим раствором.
И инкубировать флакон на ночь при комнатной температуре с возбуждением. Наконец, мыть рыбу три раза в течение 15 минут с PBST. Используя этот протокол, поверхностные рыбы Тинаджа, Молино и Пахон пещерные рыбы были выведены в статических резервуарах для разведения.
Поверхность и пашон нерестится, с оплодотворенными эмбрионами, всегда производятся вылупившихся личинок. В то время как Молино и Тинаджа были неудачными некоторое время. В целом, поверхностная рыба произвела наибольшее количество личинок на нерест, за которыми следуют Пахон, Тинаджа и Молино соответственно.
Целая техника иммуностимации была успешно использована для обозначения нейронов и клеток поджелудочной железы на стадиях до 12,5 дней после оплодотворения. Важно, чтобы удалить любые мертвые рыбы, как вы поднимаете личинок и записывать количество выживших рыб. Если многие рыбы умирают это может быть связано с бактериальным или грибкового загрязнения.
Танки должны быть стерилизованы с 70% этанола до использования. Техника иммуностиминга, которую мы описали, успешно используется для антител, перечисленных в таблице материалов. После иммуностимулятора, рыба может быть цельной установлен или секционированы для просмотра любой ткани, представляющие интерес.
В сочетании, селекционная, инкубационная и иммуностетенная процедура обеспечивают надежный метод оценки активности генов NC2 таким образом, сопоставимый между лабораториями.
