Hier zeigen wir, wie man den mexikanischen Tetra Astyanax Mexicanus züchtet, die Larven aufzieht und eine ganzwertige Immunhistochemie an Postlarvenfischen durchführt, um die Phänotypen von Fluss- und Höhlenfischen zu vergleichen. Wir züchten die Fische mit der gleichen Dichte auf einer nährstoffreichen Ernährung von Fäifern. Diese Technik sorgt für gleichbleibendes Wachstum und bietet Vorteile in Bezug auf Kosten, Biosicherheit und Wasserqualität.
Um zu beginnen, legen Sie ein Kunststoffgewebe in den Boden eines Fünf-Gallonen-Tanks. Dann füllen Sie den Tank mit fischfertigem Wasser. Befestigen Sie einen Warmwasserbereiter an der Seite des Tanks.
Fügen Sie ein Weibchen und zwei männliche Astyanax Mexicanus Fische, die mehr als ein Jahr alt sind, in den Tank. Stellen Sie die Temperatur des Warmwasserbereiters auf 24 Grad Celsius ein. Nach 24 Stunden, erhöhen Sie die Temperatur um ein Grad Celsius.
Leuchten Sie jeden Tag eine Taschenlampe in den Boden des Tanks, um nach Eiern zu suchen. Sobald die Eier im Zuchtbecken identifiziert sind, entfernen Sie die erwachsenen Fische und das Plastikgitter. Verwenden Sie ein Becherglas, um die Wassertiefe auf 10 cm zu reduzieren.
Um den Zeitpunkt der Befruchtung abzuschätzen, verwenden Sie eine Transferpipette, um mehrere Eier in eine Petrischale zu legen und sie mit einem Stereomikroskop zu betrachten, um ihr Stadium zu bestimmen. Entfernen Sie undurchsichtige Eier oder Kot. Dann füllen Sie den Tank mit fischfertigem Wasser und fügen Sie sieben Tropfen Methylenblau ins Wasser.
Danach eine Heizung und eine Aquarienblase in den Tank geben. Stellen Sie die Heizung auf 24 Grad Celsius ein und stellen Sie den Luftstromregler ein, um einen sanften Blasenstrom zu erzeugen. Dann bedecken Sie den Tank, um die Wassertemperatur zu halten.
20 Gramm Salz in acht Liter Fischbereites Wasser geben und rühren, bis es aufgelöst ist. Dann fügen Sie einen Liter des vorbereiteten Wassers zu jedem Kindergartenbehälter hinzu. Als nächstes verwenden Sie eine Transferpipette, um 20 der geschlüpften Larven in jeden Kinderzimmerbehälter zu bewegen.
Rühre das Wasser im größeren Tank, um sicherzustellen, dass alle Larven entfernt wurden. Um das Fischfutter zuzubereiten, fügen Sie drei ml Algenmischung zu einem Liter geernteter Fälscher hinzu. Fünf Tage nach der Düngung fügen Sie drei ml fischfutter in jeden Kinderkübel.
Die Fäulnissollten in dichten Gruppen an der Ecke der Container sichtbar sein, es sei denn, sie sind in der Nähe der Mitte sichtbar. Überprüfen Sie den Behälter auf Fäder jeden Tag und fügen Sie mehr Nahrung hinzu, wenn die Konzentration erschöpft ist. Entfernen Sie alle toten Larven.
Zuerst, um den Magen-Darm-Trakt von Lebensmitteln zu löschen, gießen Sie den Kinderzimmerbehälter mit den Fischen des gewünschten Alters durch ein Nylon-Mesh-Sieb. Legen Sie das Sieb in einen Behälter mit sauberem Fischbereitwasser und halten Sie Lebensmittel für 24 Stunden zurück. Nach der Einschläfernisierung der Fische, nach den institutionellen Richtlinien, verwenden Sie eine Transferpipette, um den Fisch in ein konisches Rohr zu übertragen.
Ersetzen Sie die Euthanasielösung durch fixative. Und bebrüten die Röhre mit Schaukeln über Nacht bei 4 Grad Celsius. Entfernen Sie danach das Fixativ und ersetzen Sie es durch PBST.
Inkubieren Sie die Röhre für weitere 15 Minuten mit Schaukeln. Und wiederholen Sie den Waschvorgang noch einmal. Als nächstes verwenden Sie eine Transferpipette, um den Fisch auf eine vier ml Glasdurchstechflasche mit einer Schraubkappe zu bewegen.
Entfernen Sie den PBST aus der Durchstechflasche und fügen Sie drei ml Blockierlösung hinzu. Die Durchstechflasche bei Raumtemperatur eine Stunde lang mit Schaukeln bebrüten. Danach verwenden Sie eine Transferpipette, um die Blockierlösung zu entfernen und durch primären Antikörper zu ersetzen, der in einer Blockierlösung verdünnt wird.
Inkubieren Sie die Durchstechflasche über Nacht bei Raumtemperatur mit Rührung. Als nächstes waschen Sie den Fisch mit PBST dreimal, wie zuvor beschrieben. Ersetzen Sie den PBST durch sekundären Antikörper, der in einer Blockierenden Lösung verdünnt wird.
Und die Durchstechflasche über Nacht bei Raumtemperatur mit Rührung bebrüten. Schließlich waschen Sie den Fisch dreimal für 15 Minuten mit PBST. Mit diesem Protokoll wurden Oberflächenfische Tinaja, Molino und Pachon Höhlenfische in statischen Zuchtbecken gezüchtet.
Die Oberfläche und Pachon laichen, mit befruchteten Embryonen, produzierten immer geschlüpfte Larven. Während die Molino und Tinaja waren einige der Zeit erfolglos. Im Allgemeinen produzierten Oberflächenfische die größte Anzahl von Larven pro Laich, gefolgt von Pachon, Tinaja und Molino.
Die ganzheitliche Immunfärbungstechnik wurde erfolgreich eingesetzt, um Neuronen und Bauchspeicheldrüsenzellen in Stadien bis zu 12,5 Tagen nach der Befruchtung zu kennzeichnen. Es ist wichtig, alle toten Fische zu entfernen, während Sie die Larven erhöhen und die Anzahl der überlebenden Fische aufzeichnen. Wenn viele Fische sterben, kann dies an einer bakteriellen oder Pilzkontamination verursacht werden.
Tanks sollten vor der Verwendung mit 70% Ethanol sterilisiert werden. Die von uns beschriebene Immunostaining-Technik wurde erfolgreich für die in der Materialtabelle aufgeführten Antikörper eingesetzt. Nach der Immunostainierung können Fische ganz montiert oder geschnitten werden, um jedes Gewebe von Interesse zu sehen.
In Kombination bieten das Züchtungs-, Brut- und Immunstainierungsverfahren eine robuste Methode zur Beurteilung der Genaktivität NC2 in einer zwischen Laboratorien vergleichbaren Weise.
