Nosso laboratório usa drosophila melanogaster para identificar e caracterizar genes e caminhos que regulam a função mitocondrial durante o desenvolvimento e a homeostase fisiológica. O protocolo aqui apresentado utiliza imagens vivas com adição de peróxido de hidrogênio para visualizar os efeitos dos danos oxidativos na localização e dinâmica das estruturas subcelulares no ovário Drosophila adulto. Frequentemente usamos protocolos de imagem para estudar como as mutações alteram a localização e o movimento mitocondrial normais em células germinativas femininas.
No decorrer de nossos estudos, descobrimos que o estresse introduzido por dissecção ou outros estressores celulares teve um impacto profundo na localização mitocondrial. Como controle para identificar se o estresse geral, ao contrário do tratamento experimental, é a causa de quaisquer alterações na localização ou comportamento das estruturas subcelulares. Desenvolvemos este protocolo para introduzir o estresse de controle usando peróxido de hidrogênio.
Neste vídeo, vamos demonstrar como o peróxido de hidrogênio induzido dano oxidativo altera a distribuição de mitocôndrias e da ribonucleoproteína Clu. A mídia mais adequada para esta técnica de imagem ao vivo continha a mídia Drosophila de Schneider contendo soro bovino fetal inativado de 15%, 0,6 X Caneta-Estreptococos, e 200 microgramas por insulina bovina microliter, a partir de agora referida como mídia completa de Schneider. Realizar a preparação da mídia em condições estéreis garantirá que ela não seja contaminada.
Misture bem o conteúdo e armazene durante a noite a quatro graus. A insulina não se dissolve completamente na mídia completa de Schneider e você notará um precipitado se estabelecer no fundo do tubo. Faça alíquotas, com certeza deixe este precipitado, pois vai interferir com a imagem.
Esta solução pode ser usada por um mês se armazenada em alíquotas a quatro graus. Para uma imagem de célula germinação feminina ideal, primeiro prepare um frasco contendo um pouco de pasta de levedura molhada que é a consistência da manteiga de amendoim. Isso garante que as fêmeas estejam bem alimentadas e produzam todos os estágios de desenvolvimento do folículo para a imagem.
Para moscas de melhor forma saudável, colete fêmeas de zero a um dia de idade e transfira com machos em um frasco de comida de mosca contendo pasta de levedura molhada. Certifique-se de que as moscas adormecidas não entrem em contato com a pasta de levedura, pois elas podem grudar nela. Alimente as moscas de três a sete dias, trocando a pasta de levedura diariamente.
Certifique-se de que a pasta de levedura entre em contato com a comida de mosca, para que não seque. Para induzir danos oxidativos, usaremos uma solução de estoque de 30% de peróxido de hidrogênio e para visualizar mitocôndrias, usaremos uma solução de estoque de 100 mililitros TMRE. É importante preparar as soluções de mídia frescas porque o peróxido de hidrogênio é suscetível à oxidação e o TMRE se degrada ao longo do tempo.
Logo antes da dissecção, na mídia completa de Schneider, prepare uma alíquota fresca de dois peróxido de hidrogênio micromolar, uma alíquota fresca de 46 TMRE nanomolar, e uma alíquota fresca de 46 nanomolar TMRE mais dois peróxido de hidrogênio micromolar. Para dissecção do ovário você vai precisar de dois pares de fórceps finos e um par de agulhas de tungstênio eletróis afiadas. Para dissecar os ovários encher um vidro de relógio com a mídia completa de Schneider que foi aquecida à temperatura ambiente, em seguida, coloque uma única mosca na mídia usando fórceps.
Segure suavemente a mosca pelo tórax usando um par de fórceps finos. Com as outras fórceps, segure o posterior e puxe suavemente para remover os ovários. Remova qualquer cutícula ou tecido íntegro e transfira o ovário para um novo poço que contenha mídia fresca.
Os ovários ainda devem estar se movendo da baia muscular circundante. Usando as agulhas de tungstênio afiadas, provoque delicadamente os ovários, tomando cuidado para remover a baia muscular circundante. Se a baia muscular não for removida, como demonstrado aqui, a ovaria se contrairá, causando problemas com a aquisição de imagem.
Uma vez que os ovários tenham sido dissecados limpamente, transfira-os em uma queda de 100 microliteres de mídia para um prato MatTek se visualizar estruturas endógenamente rotuladas. Transfira os ovários em uma gota de 100 microliteres de mídia TMRE para um prato MatTek se visualizar mitocôndrias rotuladas com TMRE. Os ovários afundarão no fundo da gotícula.
É importante praticar dissecções para começar a fotografar o tecido o mais rápido possível. Uma vez que os ovários são montados, coloque o prato no microscópio invertido e adquira imagens estádas ou vídeos breves como um registro de condições de pré-tratamento. Feito isso, pause a imagem ao vivo, remova a tampa e adicione cuidadosamente 100 microliters da solução preparada por peróxido de hidrogênio micromolar.
Evite quebrar a superfície da gota de mídia existente ou adicionar a solução muito rapidamente, para não deslocar os ovários que estão na parte inferior. Substitua a tampa do prato, reloje e refoque o ovário desejado e retome a imagem. Tome cuidado para retomar a imagem o mais rápido possível, pois o tratamento experimental é sensível ao tempo.
Mostradas aqui estão imagens de um filme, tiradas após tratamento de peróxido de hidrogênio. Mitocôndrias e células germinativas femininas são dispersas por todo o citoplasma quando as moscas são bem alimentadas e saudáveis. Após a adição de peróxido de hidrogênio, o dano oxidativo faz com que as mitocôndrias se desprestíam, o que pode ser visto tão rapidamente quanto 10 minutos após o tratamento.
Após 20 minutos, o dano faz com que o potencial da membrana mitocondrial se dissipe. Assim, a maioria das mitocôndrias desaparecem. Neste filme ao vivo do processo, mitocôndrias podem ser vistas rapidamente se aglomerando e a maioria das mitocôndrias finalmente desaparecem.
O pulsante piscando no citoplasma, particularmente nas células folículos circundantes, parece característico da adição de TMRE. Como mencionado anteriormente, a imagem deve ocorrer rapidamente após a adição de peróxido de hidrogênio. Como mostrado aqui, se muito tempo decorrido, o potencial da membrana mitocondrial já está perdido e a rotulagem TMRE se dissipa, tornando os dados irrepreutáveis.
Nestas imagens estámais de vídeo, as partículas clu endógenas rotuladas pela GFP são robustas e abundantes no germoplasma de fêmeas bem alimentadas. Após a adição de peróxido de hidrogênio, as partículas clu se dispersam em 10 minutos. Isso é demonstrado no vídeo que acompanha.
Após a adição de peróxido de hidrogênio, as partículas de felicidade clu se dispersam rapidamente. Descobrimos que este protocolo é uma ferramenta útil para garantir imagens precisas da localização selvagem de mitocôndrias e partículas de felicidade clu em células germinativas femininas de Drosophila. Este protocolo deve ser aplicável para uma ampla gama de estudos de imagem ao vivo e poderia ser usado para tratar tecidos antes da fixação também.
Os passos mais importantes são isolar os ovários livres da baia muscular, adicionar suavemente o peróxido de hidrogênio, para não desalojar os ovários, e a imagem rapidamente após a adição de peróxido de hidrogênio. Esperamos que você encontre este um controle útil para imagens ao vivo uma variedade de estruturas subcelulares. Obrigado por assistir e boa sorte com suas experiências.
