Erken aşama tohumlama aşılaması, bitkilerde uzun mesafeli sinyalizasyonu ayarlamak için güçlü bir araçtır. Bu yöntemin, uygulamalı eğitim olmadan tohumlama aşılamasının başarılı bir şekilde benimsenmesine yardımcı olacağını umuyoruz. Silikon elastomerin dökümü için 100x100 milimetre ölçülerinde kare Petri kabını hazırlayarak başlayın.
Tel üzerindeki dış kağıt kaplamasını asetonla çıkardıktan sonra bükümlü bağlarda 29 gauge tel alın. Ve teli, metal bir tüp rafı gibi ağır düz bir nesneyle sert, düzgün bir yüzeye yuvarlayarak tamamen düzeltin. Ardından, kare Petri kabına birbirinden eşit uzaklıkta dört adet düzleştirilmiş tel yerleştirin ve tellerin çanağın dibinde düz durmasını sağlayın.
Karışık silikon elastomer çözeltisini Petri kabındaki tellerin üzerine dökün ve kapağı kabın üzerine yerleştirin. Silikonun oda sıcaklığında 24 ila 48 saat boyunca sertleşmesine izin verdikten sonra, silikon tabakayı temiz forseps kullanarak Petri kabından çıkarın ve temiz, düz bir yüzeye taşıyın. Telleri silikon tabakadan çıkarın.
Kanalların bir tarafta açık olduğundan emin olmak için, kanalların açık tarafını tıkayan ince silikon tabakasını temizlemek için ince noktalı forseps kullanın. Kanallara dik silikon levhayı temiz makas kullanarak üç milimetrelik şeritler halinde kesin. Her şeridi alüminyum bir folyo zarfa yerleştirin ve otoklav bantla kapatın.
Şeritleri 121 santigrat derecede en az 30 dakika boyunca otoklavlayın ve gerekli olana kadar saklayın. Tohumları sterilize etmek ve vernalize etmek için, 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde% 0.1 Tween 20 içeren bir mililitre% 50 ağartıcı çözeltisi alın ve içinde 100 adede kadar arabidopsis tohumu askıya alın. Tohum süspansiyonunu oda sıcaklığında beş ila 10 dakika inkübe edin.
İnkübasyon sonrası, steril koşullar altında ağartıcı çözeltisini aspire edin veya pipetleyin. Tohumları bir mililitre sterilize damıtılmış su ile durulayın. Tohumları durularken tüpleri yeterince ters çevirdiğinizden emin olun.
Tüpün üstünde kalan herhangi bir ağartıcı çözeltisini çıkarmak için, durulamayı dört kez tekrarlayın. Tohumları tüpte bulunan yaklaşık 250 mikrolitre su bırakın ve tohumları karanlıkta üç gün boyunca dört santigrat derecede saklayın. Daha sonra, tohumları kaplamadan önce, tohum hizalamasını şeritler üzerindeki kanallarla yönlendirmek için steril şeritleri hazırlanan MS plakasının yüzeyine yerleştirin.
Daha sonra, steril koşullar altında çalışırken, uygun sayıda hazırlanmış tohumu aspire etmek ve plakaya aktarmak için 20 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın. Tohumlar kaplandıktan sonra, steril şeritleri çıkarın. Plakayı örtün.
Ve plakanın kenarlarından birini, tohum sıralarına paralel olarak parafilm ile kapatın. Kuluçka sırasında hava değişimine izin vermek için parafilmin üstüne ve plakanın diğer tüm kenarlarına nefes alabilen bant sarın. İki plakayı, parafilm sızdırmaz kenarları aşağı bakacak şekilde dikey olarak dikkatlice yönlendirin.
Bunları alttan ayırın, aralarına yatay olarak 15 mililitrelik bir santrifüj tüpü yerleştirirken, üstte bir lastik bantla sabitleyin. Plaka yüzeylerinin tezgah üstü yüzeyle 100 ila 110 arasında bir açı oluşturduğundan emin olun. Fide hipokotillerinin yaklaşık beş milimetre uzunluğunda büyümesine izin vermek için plakaları bu yönde 72 saat boyunca toplam karanlıkta 21 santigrat derecede saklayın.
Bundan sonra, kurulumu karanlıktan çıkarın ve aşılamadan önce aynı sıcaklıkta iki ila dört gün boyunca 16 saatlik bir ışık ve sekiz saatlik karanlık döngü altında tutun. Fideleri kaplandıktan beş ila yedi gün sonra aşılayın. Fidelerin üzerine, hipokotillerini kanallara yerleştirerek bir aşılama şeridi yerleştirin.
Fideyi yavaşça konumlandırın, böylece fideyi kesime hazırlamak için kök-hipokotil bağlantısı silikon şeridin dibinde kalır. Bir diseksiyon kapsamı yardımıyla steril bir başlıkta çalışarak, scionları aşılama için hazırlayın. Taze bir neşter bıçağı kullanarak, hipokotil boyunca düz, temiz, dik bir kesim yapın.
Fideyi aşağı bastırmaktan ve agarın içine itmekten kaçının. Daha sonra, oluğu çıkarın ve ortam yüzeyiyle teması sağlayarak oluğun kesilmiş kısmını nemli tutun. Alternatif olarak, oluk steril damıtılmış suyla doldurulmuş bir Petri kabına taşınabilir.
Anaçları hazırlamak için, kökü kapalı forseps arasındaki boşlukta dikkatlice kavrayın ve anaçların kesilmiş bölümünü şeridin ortasında bırakarak çekmek için yavaşça çevirin. Ardından, ince uçlu forsepsleri kullanarak istediğiniz oluğu yavaşça alın ve kanalın üst kısmına yerleştirin. Görsel olarak, başarılı bir greft elde etmek için filiz ve anaç arasındaki teması onaylayın.
Tüm greftler yapıldıktan sonra, plakaları parafilm ve nefes alabilen bantla sarın ve fideleri veya silikon şeritleri rahatsız etmeden plakaları daha önce gösterildiği gibi ayarlayın. Plakaları, 16 saatlik bir ışık ve sekiz saatlik karanlık döngü ile 26 santigrat dereceye ayarlanmış bir büyüme odasına dikkatlice taşıyın. Yedi ila 10 gün sonra, silikon şeridi bir taraftan dikkatlice soymak ve fideleri kanallardan serbest bırakmak için forseps kullanarak aşılanmış fideleri steril koşullar altında değerlendirin.
Filizden büyüyen maceracı kökleri taze bir neşter bıçağıyla keserek veya ince uçlu forsepslerle ezerek çıkarın. Bir kez daha, anaçların başarılı bir greft oluşturan filize sıkıca yapışıp bağlanmadığını görsel olarak değerlendirin. Başarılı greftleri fide çoğaltma toprağına taşıyın ve fideler kurulurken toprağı birkaç gün şeffaf plastikle örtün.
Bitkilerin daha önce bahsedilen ışık ve karanlık döngüleri altında 21 santigrat derecede büyümesine izin verin. Optimal aşılama protokolünü belirlemek için yapılan aşılama çalışmaları, tohumlar doğrudan kapalı kanallara sahip silikon şeritler üzerinde çimlendiğinde% 25'lik bir genel aşılama başarı oranı ortaya koymuştur. Tohumların embriyoların kotiledonlarını tutacak şekilde yeniden yönlendirilmesi ve çimlenme sırasında radikalin aşağıya doğru işaret etmesi, aşılama verimliliğini% 33'e hafifçe arttırdıTohum ile büyüme ortamı arasında temasa izin vermek için kanallardaki silikon kapanmasını çıkardıktan sonra, fidelerin% 85'i başarıyla çimlendi.
Bununla birlikte, aşılama başarı oranı% 31'de kalmıştır, bu da şerit üzerinde çimlenme ile optimal fide büyümesinin sağlanamayacağını göstermektedir. İlginç bir şekilde, fidelerin şeritlerdeki açık kanallara yerleştirilmeden önce aşılama plakası üzerinde dikey olarak yetiştirildiği gösterilen protokol, ilk iki deneme sırasında% 48'e kadar genel bir aşılama başarı oranı sağlamıştır. Üçüncü ve nispeten küçük çalışmanın düşük başarı oranı göz önüne alındığında, aşılama bölgelerindeki hafif değişikliklere atfedilebilecek genel aşılama başarısının% 45 olduğu bulunmuştur Bu, fidelerin yatay plakalarda yetiştirildiği, katı bir yüzeyde kesildiği ve aşılama şeritlerine yerleştirildiği yöntemle karşılaştırılabilir.
Bununla birlikte, gösterilen protokol nispeten daha az zaman alıcıdır. Bu protokolü kullanarak, fide aşılamada yeni olan laboratuvarlar, cihazı kendi özel ihtiyaçlarına kolayca uyacak şekilde özelleştirirken hızla çok sayıda aşılama destek cihazı oluşturabilir.
