Le greffage de semis à un stade précoce est un outil puissant pour établir la signalisation à longue distance chez les plantes. Nous espérons que cette méthode contribuera à l’adoption réussie du greffage d’ensemencement sans formation pratique. Commencez par préparer la boîte de Petri carrée, mesurant 100x100 millimètres pour couler l’élastomère de silicone.
Prenez le fil de calibre 29 dans des attaches torsadées après avoir retiré le revêtement de papier extérieur sur le fil avec de l’acétone. Et redressez complètement le fil en le roulant sur une surface dure et uniforme avec un objet plat lourd, comme un support de tube métallique. Ensuite, posez quatre morceaux de fils redressés équidistants les uns des autres dans la boîte de Petri carrée, en veillant à ce que les fils reposent à plat sur le fond de la parabole.
Versez la solution d’élastomère de silicium mélangé sur les fils de la boîte de Petri et placez le couvercle sur la boîte. Après avoir laissé durcir le silicone pendant 24 à 48 heures à température ambiante, retirez la feuille de silicone de la boîte de Petri à l’aide d’une pince propre et déplacez-la sur une surface propre et plane. Retirez les fils de la feuille de silicone.
Pour vous assurer que les canaux sont ouverts d’un côté, utilisez des pinces à pointe fine pour nettoyer la fine couche de silicone bloquant le côté ouvert des canaux. Couper la feuille de silicone perpendiculairement aux canaux en bandes de trois millimètres à l’aide de ciseaux propres. Placez chaque bande dans une enveloppe en papier d’aluminium et scellez-la avec du ruban autoclave.
Autoclaver les bandes à 121 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes avant de les stocker jusqu’à ce que nécessaire. Pour stériliser et vernaliser les graines, prenez un millilitre de solution d’eau de Javel à 50% contenant 0,1% de Tween 20 dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre et suspendez-y jusqu’à 100 graines d’arabidopsis. Incuber la suspension de graines à température ambiante pendant cinq à 10 minutes.
Post-incubation, aspirer ou pipeter la solution d’eau de Javel dans des conditions stériles. Rincez les graines avec un millilitre d’eau distillée stérilisée. Assurez-vous de retourner les tubes adéquatement pendant le rinçage des graines.
Pour enlever toute solution d’eau de Javel laissée en haut du tube, répétez le rinçage quatre fois. Laissez environ 250 microlitres d’eau avec les graines dans le tube et conservez les graines dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pendant trois jours. Ensuite, avant de plaquer les graines, placez les bandes stériles sur la surface de la plaque MS préparée pour guider l’alignement des graines avec les canaux sur les bandelettes.
Ensuite, en travaillant dans des conditions stériles, utilisez une pointe de pipette de 20 microlitres pour aspirer et transférer le nombre approprié de graines préparées sur la plaque. Une fois les graines plaquées, retirez les bandelettes stériles. Couvrir l’assiette.
Et scellez l’un des côtés de la plaque parallèle aux rangées de graines avec du parafilm. Enroulez du ruban adhésif respirant sur le dessus du parafilm et autour de tous les autres bords de la plaque pour permettre l’échange d’air pendant l’incubation. Orientez soigneusement deux plaques verticalement avec leurs côtés scellés au parafilm vers le bas.
Séparez-les en bas en plaçant horizontalement un tube centrifuge de 15 millilitres entre les deux, tout en les fixant ensemble sur le dessus avec un élastique. Assurez-vous que les surfaces de la plaque forment un angle de 100 à 110 avec la surface de la paillasse. Conservez les plaques dans cette orientation pendant 72 heures dans l’obscurité totale à 21 degrés Celsius pour permettre aux hypocotyles des plantules de croître d’environ cinq millimètres de longueur.
Après quoi, retirez la configuration de l’obscurité et maintenez-la sous un cycle de lumière de 16 heures et un cycle d’obscurité de huit heures pendant deux à quatre jours à la même température avant la greffe. Greffez les plantules entre cinq et sept jours après avoir été plaquées. Placez une bande de greffe sur les plantules en insérant leurs hypocotyles dans les canaux.
Positionnez doucement le semis de sorte que la jonction racine-hypocotyle reste au bas de la bande de silicone pour préparer le plant à la coupe. En travaillant dans une hotte stérile à l’aide d’une lunette de dissection, préparez les greffons pour la greffe. À l’aide d’une lame de scalpel fraîche, faites une coupe droite, propre et perpendiculaire à travers l’hypocotyle.
Évitez d’appuyer et de pousser le semis dans l’agar-agar. Ensuite, retirez la goulotte et maintenez la partie coupée de la goulotte hydratée en assurant le contact avec la surface du média. Alternativement, la goulotte peut être déplacée dans une boîte de Petri remplie d’eau distillée stérile.
Pour préparer les porte-greffes, saisissez soigneusement la racine dans l’espace entre les pinces fermées et tournez doucement pour la tirer, en laissant la section coupée des porte-greffes au milieu de la bande. Ensuite, prenez doucement la goulotte souhaitée à l’aide de la pince à pointe fine et insérez-la dans le haut du canal. Visuellement, confirmez le contact entre le greffon et le porte-greffe pour obtenir une greffe réussie.
Une fois que toutes les greffes ont été faites, enveloppez les plaques avec du parafilm et du ruban respirant, et installez les plaques de la même manière que démontré précédemment sans déranger les semis ou les bandes de silicone. Déplacez délicatement les plaques dans une chambre de croissance réglée à 26 degrés Celsius avec un cycle de lumière de 16 heures et un cycle d’obscurité de huit heures. Après sept à 10 jours, évaluez les plantules greffées dans des conditions stériles en utilisant des forceps pour décoller soigneusement la bande de silicone d’un côté et libérer les plantules des canaux.
Enlevez toutes les racines adventives qui poussent du greffon en les coupant avec une lame de scalpel fraîche ou en les écrasant avec une pince à pointe fine. Encore une fois, évaluez visuellement si le porte-greffe est fermement attaché au greffon formant une greffe réussie. Déplacez les greffons réussis sur le sol de multiplication des semis et recouvrez le sol de plastique transparent pendant quelques jours pendant que les semis s’établissent.
Laissez les plantes pousser sous les cycles de lumière et d’obscurité mentionnés précédemment à 21 degrés Celsius. Les essais de greffage visant à déterminer le protocole de greffage optimal ont révélé un taux de réussite global de la greffe de 25% lorsque les graines ont germé directement sur les bandes de silicone avec des canaux fermés. La réorientation des graines pour maintenir les cotylédons des embryons et le radical pointant vers le bas pendant la germination a légèrement augmenté l’efficacité de greffage à 33%Lors du retrait de la fermeture en silicone sur les canaux pour permettre le contact entre la graine et le milieu de croissance, 85% des plantules ont germé avec succès.
Cependant, le taux de réussite de la greffe est resté à 31%, ce qui indique qu’une croissance optimale des plantules ne pouvait pas être atteinte avec la germination sur bande. Fait intéressant, le protocole démontré dans lequel les plantules ont été cultivées verticalement sur la plaque de greffage avant d’être insérées dans les canaux ouverts dans les bandes a donné un taux global de réussite de greffe à 48% au cours des deux premiers essais. Compte tenu du taux de réussite plus faible du troisième essai et de la relativement petite échelle, qui peut être attribuée à de légères variations dans les sites de greffe, le succès global de la greffe s’est avéré être de 45%.
Cependant, le protocole démontré prend comparativement moins de temps. En utilisant ce protocole, les laboratoires novices en matière de greffe de semis peuvent rapidement créer un grand nombre de dispositifs de soutien de greffe tout en étant en mesure de personnaliser facilement le dispositif pour répondre à leurs besoins spécifiques.
