Die Pfropfung der Aussaat im Frühstadium ist ein leistungsfähiges Werkzeug zum Einstellen von Fernsignalen in Pflanzen. Wir hoffen, dass diese Methode dazu beitragen wird, die Pfropfung ohne praktisches Training erfolgreich einzuführen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der quadratischen Petrischale mit den Maßen 100 x 100 Millimeter zum Gießen des Silikonelastomers.
Nehmen Sie 29-Gauge-Draht in Twist-Binder, nachdem Sie die äußere Papierbeschichtung auf dem Draht mit Aceton entfernt haben. Und richten Sie den Draht vollständig aus, indem Sie ihn auf einer harten, gleichmäßigen Oberfläche mit einem schweren, flachen Gegenstand wie einem Metallrohrgestell rollen. Legen Sie dann vier Stücke begradigter Drähte in gleichem Abstand voneinander in die quadratische Petrischale und stellen Sie sicher, dass die Drähte flach auf dem Boden der Schale liegen.
Gießen Sie die gemischte Silikonelastomerlösung auf die Drähte in der Petrischale und legen Sie den Deckel auf die Schale. Nachdem Sie das Silikon 24 bis 48 Stunden bei Raumtemperatur aushärten gelassen haben, entfernen Sie die Silikonfolie mit einer sauberen Pinzette aus der Petrischale und bewegen Sie sie auf eine saubere, ebene Oberfläche. Entfernen Sie die Drähte von der Silikonfolie.
Um sicherzustellen, dass die Kanäle auf einer Seite offen sind, verwenden Sie eine Feinspitzzange, um die dünne Silikonschicht zu entfernen, die die offene Seite der Kanäle blockiert. Schneiden Sie die Silikonfolie senkrecht zu den Kanälen mit einer sauberen Schere in drei Millimeter große Streifen. Legen Sie jeden Streifen in einen Aluminiumfolienumschlag und verschließen Sie ihn mit Autoklavenband.
Autoklavieren Sie die Streifen mindestens 30 Minuten lang bei 121 Grad Celsius, bevor Sie sie lagern, bis sie benötigt werden. Um die Samen zu sterilisieren und zu vernalisieren, nehmen Sie einen Milliliter 50%ige Bleichlösung mit 0,1% Tween 20 in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und suspendieren Sie bis zu 100 Arabidopsis-Samen darin. Inkubieren Sie die Samensuspension fünf bis 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
Nach der Inkubation die Bleichlösung unter sterilen Bedingungen absaugen oder pipettieren. Spülen Sie die Samen mit einem Milliliter sterilisiertem destilliertem Wasser ab. Achten Sie darauf, die Röhrchen beim Spülen der Samen ausreichend umzudrehen.
Um die oben auf dem Röhrchen verbliebene Bleichlösung zu entfernen, wiederholen Sie das Spülen viermal. Lassen Sie etwa 250 Mikroliter Wasser mit den Samen in der Tube und lagern Sie die Samen drei Tage lang im Dunkeln bei vier Grad Celsius. Als nächstes legen Sie vor dem Anplattieren der Samen die sterilen Streifen auf die Oberfläche der vorbereiteten MS-Platte, um die Samenausrichtung mit den Kanälen auf den Streifen zu führen.
Verwenden Sie dann unter sterilen Bedingungen eine 20-Mikroliter-Pipettenspitze, um die entsprechende Anzahl vorbereiteter Samen abzusaugen und auf den Teller zu übertragen. Sobald die Samen plattiert sind, entfernen Sie die sterilen Streifen. Decken Sie den Teller ab.
Und versiegeln Sie eine der Seiten des Tellers parallel zu den Samenreihen mit Parafilm. Wickeln Sie atmungsaktives Klebeband auf die Oberseite des Parafilms und um alle anderen Kanten der Platte, um den Luftaustausch während der Inkubation zu ermöglichen. Richten Sie zwei Platten vorsichtig senkrecht aus, wobei die mit Parafolie versiegelten Seiten nach unten zeigen.
Trennen Sie sie unten, indem Sie ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen horizontal dazwischen platzieren und oben mit einem Gummiband befestigen. Stellen Sie sicher, dass die Plattenoberflächen einen Winkel von 100 bis 110 zur Tischfläche bilden. Lagern Sie die Platten in dieser Ausrichtung 72 Stunden lang in völliger Dunkelheit bei 21 Grad Celsius, damit die Hypokotyle der Sämlinge etwa fünf Millimeter lang werden können.
Entfernen Sie danach das Setup aus dem Dunkeln und halten Sie es vor dem Pfropfen zwei bis vier Tage lang bei gleicher Temperatur unter einem 16-stündigen Licht- und einem achtstündigen Dunkelzyklus. Pfropfen Sie die Sämlinge zwischen fünf und sieben Tagen nach dem Anplattieren. Legen Sie einen Pfropfstreifen über die Sämlinge und passen Sie ihre Hypokotyle in die Kanäle an.
Positionieren Sie den Sämling vorsichtig, so dass der Wurzel-Hypokotyl-Übergang am unteren Rand des Silikonstreifens verbleibt, um den Sämling für den Schnitt vorzubereiten. Arbeiten Sie in einer sterilen Haube mit Hilfe eines Dissektionsfernrohrs und bereiten Sie die Sprossen für die Transplantation vor. Machen Sie mit einer frischen Skalpellklinge einen geraden, sauberen, senkrechten Schnitt über das Hypokotyl.
Vermeiden Sie es, den Sämling nach unten zu drücken und in den Agar zu drücken. Entfernen Sie als Nächstes die Rutsche und halten Sie den geschnittenen Teil der Rutsche mit Feuchtigkeit versorgt, indem Sie den Kontakt mit der Medienoberfläche sicherstellen. Alternativ kann die Rutsche in eine mit sterilem destilliertem Wasser gefüllte Petrischale gebracht werden.
Um die Wurzelstöcke vorzubereiten, fassen Sie die Wurzel vorsichtig im Raum zwischen den geschlossenen Pinzetten und drehen Sie sie vorsichtig, um sie zu ziehen, wobei der geschnittene Abschnitt der Wurzelstöcke in der Mitte des Streifens verbleibt. Nehmen Sie dann die gewünschte Rutsche vorsichtig mit der Pinzette mit feiner Spitze auf und führen Sie sie in die Oberseite des Kanals ein. Bestätigen Sie visuell den Kontakt zwischen Spross und Wurzelstock, um ein erfolgreiches Transplantat zu erhalten.
Nachdem alle Transplantate hergestellt wurden, wickeln Sie die Platten mit Parafilm und atmungsaktivem Klebeband ein und richten Sie die Platten auf die gleiche Weise wie zuvor gezeigt ein, ohne die Sämlinge oder Silikonstreifen zu stören. Bewegen Sie die Platten vorsichtig in eine Wachstumskammer bei 26 Grad Celsius mit einem 16-stündigen Licht- und einem achtstündigen Dunkelzyklus. Bewerten Sie die gepfropften Sämlinge nach sieben bis 10 Tagen unter sterilen Bedingungen, indem Sie den Silikonstreifen vorsichtig von einer Seite abziehen und die Sämlinge von den Kanälen befreien.
Entfernen Sie zufällige Wurzeln, die aus dem Spross wachsen, indem Sie sie mit einer frischen Skalpellklinge schneiden oder mit einer Pinzette mit feiner Spitze zerdrücken. Beurteilen Sie noch einmal, ob der Wurzelstock fest mit dem Spross verbunden ist und ein erfolgreiches Transplantat bildet. Bewegen Sie die erfolgreichen Transplantate in die Vermehrungserde der Sämlinge und bedecken Sie die Erde einige Tage lang mit transparentem Kunststoff, während sich die Sämlinge etablieren.
Lassen Sie die Pflanzen unter den zuvor erwähnten Hell-Dunkel-Zyklen bei 21 Grad Celsius wachsen. Pfropfversuche zur Bestimmung des optimalen Pfropfprotokolls ergaben eine Gesamterfolgsrate der Pfropfung von 25%, wenn die Samen direkt auf den Silikonstreifen mit geschlossenen Kanälen keimten. Durch die Neuausrichtung der Samen, um die Keimblätter der Embryonen und die Radikale während der Keimung nach unten zu halten, wurde die Pfropfeffizienz leicht auf 33% erhöht.
Die Pfropferfolgsrate blieb jedoch bei 31 %, was darauf hindeutet, dass mit der Keimung auf dem Streifen kein optimales Wachstum der Sämlinge erreicht werden konnte. Interessanterweise ergab das demonstrierte Protokoll, bei dem die Sämlinge vertikal auf der Pfropfplatte kultiviert wurden, bevor sie in die offenen Kanäle in den Streifen eingeführt wurden, während der ersten beiden Versuche eine Gesamterfolgsrate der Pfropfung von 48%. Unter Berücksichtigung der geringeren Erfolgsrate des dritten und des relativ kleinen Versuchs, der auf geringfügige Variationen der Pfropfstellen zurückzuführen ist, wurde der Gesamterfolg der Pfropfung mit 45% festgestellt. Dies ist vergleichbar mit der Methode, bei der die Sämlinge auf horizontalen Platten kultiviert, auf einer festen Oberfläche geschnitten und in Pfropfstreifen eingesetzt wurden.
Das demonstrierte Protokoll ist jedoch vergleichsweise weniger zeitaufwändig. Mit diesem Protokoll können Labore, die neu in der Pfropfung von Sämlingen sind, schnell eine große Anzahl von Pfropfunterstützungsgeräten erstellen und gleichzeitig das Gerät problemlos an ihre spezifischen Anforderungen anpassen können.
