El injerto de siembra en etapa temprana es una herramienta poderosa para establecer la señalización de larga distancia en las plantas. Esperamos que este método ayude en la adopción exitosa del injerto de siembra sin capacitación práctica. Comience preparando la placa de Petri cuadrada, que mide 100x100 milímetros para fundir el elastómero de silicona.
Tome alambre de calibre 29 en lazos retorcidos después de quitar el recubrimiento exterior de papel en el alambre con acetona. Y enderezar completamente el cable haciéndolo rodar sobre una superficie dura y uniforme con un objeto plano pesado, como un estante de tubos de metal. Luego, coloque cuatro piezas de alambres enderezados equidistantes entre sí en la placa de Petri cuadrada, asegurándose de que los cables queden planos en el fondo del plato.
Vierta la solución de elastómero de silicio mixto sobre los cables de la placa de Petri y coloque la tapa sobre el plato. Después de dejar que la silicona se cure durante 24 a 48 horas a temperatura ambiente, retire la lámina de silicona de la placa de Petri con pinzas limpias y muévala a una superficie limpia y plana. Retire los cables de la lámina de silicona.
Para asegurarse de que los canales estén abiertos en un lado, use pinzas de punta fina para eliminar la capa delgada de silicona que bloquea el lado abierto de los canales. Corte la lámina de silicona perpendicular a los canales en tiras de tres milímetros con tijeras limpias. Coloque cada tira en un sobre de papel de aluminio y séllela con cinta de autoclave.
Autoclave las tiras a 121 grados centígrados durante al menos 30 minutos antes de almacenarlas hasta que sea necesario. Para esterilizar y vernalizar las semillas, tome un mililitro de solución de lejía al 50% que contenga 0,1% Tween 20 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y suspenda hasta 100 semillas de arabidopsis en él. Incubar la suspensión de semillas a temperatura ambiente durante cinco a 10 minutos.
Después de la incubación, aspirar o pipetear la solución de lejía en condiciones estériles. Enjuague las semillas con un mililitro de agua destilada esterilizada. Asegúrese de invertir los tubos adecuadamente mientras enjuaga las semillas.
Para eliminar cualquier solución de lejía que quede en la parte superior del tubo, repita el enjuague cuatro veces. Deje aproximadamente 250 microlitros de agua con las semillas en el tubo y almacene las semillas en la oscuridad a cuatro grados centígrados durante tres días. Luego, antes de emplatar las semillas, coloque las tiras estériles en la superficie de la placa de MS preparada para guiar la alineación de la semilla con los canales en las tiras.
Luego, trabajando en condiciones estériles, use una punta de pipeta de 20 microlitros para aspirar y transferir el número apropiado de semillas preparadas al plato. Una vez que las semillas estén emplatadas, retire las tiras estériles. Cubra el plato.
Y selle uno de los lados de la placa paralelo a las filas de semillas con parafilm. Envuelva cinta transpirable en la parte superior del parafilm y alrededor de todos los demás bordes de la placa para permitir el intercambio de aire durante la incubación. Oriente cuidadosamente dos placas verticalmente con sus lados sellados con parafilm hacia abajo.
Sepárelos en la parte inferior colocando horizontalmente un tubo de centrífuga de 15 mililitros en el medio, mientras los asegura juntos en la parte superior con una banda elástica. Asegúrese de que las superficies de la placa formen un ángulo de 100 a 110 con la superficie de sobremesa. Almacene las placas en esta orientación durante 72 horas en total oscuridad a 21 grados centígrados para permitir que los hipocótilos de las plántulas crezcan unos cinco milímetros de longitud.
Después de lo cual, retire la configuración de la oscuridad y manténgala bajo un ciclo de luz de 16 horas y ocho horas de oscuridad durante dos a cuatro días a la misma temperatura antes del injerto. Injertar las plántulas entre cinco y siete días después de haber sido plateadas. Coloque una tira de injerto sobre las plántulas, encajando sus hipocótilos en los canales.
Coloque suavemente la plántula, de modo que la unión raíz-hipocótilo permanezca en la parte inferior de la tira de silicona para preparar la plántula para el corte. Trabajando en una campana estéril con la ayuda de un endoscopio de disección, prepare los vástagos para el injerto. Usando una hoja de bisturí fresco, haga un corte recto, limpio y perpendicular a través del hipocótilo.
Evite presionar hacia abajo y empujar la plántula hacia el agar. A continuación, retire el conducto y mantenga la parte cortada del conducto hidratada asegurando el contacto con la superficie del medio. Alternativamente, el conducto se puede mover a una placa de Petri llena de agua destilada estéril.
Para preparar los portainjertos, agarre cuidadosamente la raíz dentro del espacio entre las pinzas cerradas y gire suavemente para tirar de ella, dejando la sección cortada de los portainjertos en el medio de la tira. Luego, levante suavemente el conducto deseado con las pinzas de punta fina e insértelo en la parte superior del canal. Visualmente, confirme el contacto entre el vástago y el portainjerto para obtener un injerto exitoso.
Después de que se hayan hecho todos los injertos, envuelva las placas con parafilm y cinta transpirable, y coloque las placas de la misma manera que se demostró anteriormente sin alterar las plántulas o las tiras de silicona. Mueva cuidadosamente las placas a una cámara de crecimiento establecida a 26 grados centígrados con un ciclo de luz de 16 horas y un ciclo de oscuridad de ocho horas. Después de siete a 10 días, evalúe las plántulas injertadas en condiciones estériles mediante el uso de fórceps para despegar cuidadosamente la tira de silicona de un lado y liberar las plántulas de los canales.
Retire cualquier raíz adventicia que crezca del vástago cortándolas con una cuchilla de bisturí fresco o aplastándolas con pinzas de punta fina. Una vez más, evalúe visualmente si el portainjerto se ha unido firmemente al vástago formando un injerto exitoso. Mueva los injertos exitosos al suelo de propagación de plántulas y cubra el suelo con plástico transparente durante unos días mientras las plántulas se establecen.
Permita que las plantas crezcan bajo los ciclos de luz y oscuridad mencionados anteriormente a 21 grados centígrados. Los ensayos de injerto para determinar el protocolo de injerto óptimo revelaron una tasa de éxito general del injerto del 25% cuando las semillas germinaron directamente en las tiras de silicona con canales cerrados. La reorientación de las semillas para mantener los cotiledones de los embriones y el radical apuntando hacia abajo durante la germinación aumentó ligeramente la eficiencia del injerto al 33%Al eliminar el cierre de silicona en los canales para permitir el contacto entre la semilla y el medio de crecimiento, el 85% de las plántulas germinaron con éxito.
Sin embargo, la tasa de éxito del injerto se mantuvo en el 31%, lo que indica que no se pudo lograr un crecimiento óptimo de las plántulas con la germinación en la tira. Curiosamente, el protocolo demostrado en el que las plántulas se cultivaron verticalmente en la placa de injerto antes de insertarse en los canales abiertos en las tiras produjo una tasa de éxito general de injerto del 48% durante los dos primeros ensayos. Teniendo en cuenta la menor tasa de éxito del tercer ensayo y el ensayo relativamente pequeño, que puede atribuirse a ligeras variaciones en los sitios de injerto, se encontró que el éxito general del injerto fue del 45%Esto es comparable con el método en el que las plántulas se cultivaron en placas horizontales, se cortaron sobre una superficie sólida y se insertaron en tiras de injerto.
Sin embargo, el protocolo demostrado consume comparativamente menos tiempo. Con este protocolo, los laboratorios nuevos en el injerto de plántulas pueden crear rápidamente un gran número de dispositivos de soporte de injerto al tiempo que pueden personalizar el dispositivo para satisfacer sus necesidades específicas fácilmente.
