يعد تطعيم البذر في المرحلة المبكرة أداة قوية لتحديد إشارات المسافات الطويلة في النباتات. نأمل أن تساعد هذه الطريقة في الاعتماد الناجح لتطعيم البذر دون تدريب عملي. ابدأ بإعداد طبق بتري المربع ، بقياس 100 × 100 ملم لصب المطاط الصناعي السيليكوني.
خذ سلك قياس 29 في روابط ملتوية بعد إزالة طلاء الورق الخارجي على السلك باستخدام الأسيتون. وقم بتصويب السلك بالكامل عن طريق لفه على سطح صلب وموحد بجسم مسطح ثقيل ، مثل رف الأنبوب المعدني. بعد ذلك ، ضع أربع قطع من الأسلاك المستقيمة على مسافة متساوية من بعضها البعض في طبق بتري المربع ، مع التأكد من أن الأسلاك مسطحة في قاع الطبق.
صب محلول المطاط الصناعي السيليكوني المختلط فوق الأسلاك في طبق بتري وضع الغطاء على الطبق. بعد السماح للسيليكون بالشفاء لمدة 24 إلى 48 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة ورقة السيليكون من طبق بتري باستخدام ملقط نظيف وانقلها إلى سطح نظيف ومستو. قم بإزالة الأسلاك من ورقة السيليكون.
للتأكد من أن القنوات مفتوحة على جانب واحد ، استخدم ملقط دقيق لإزالة الطبقة الرقيقة من السيليكون التي تسد الجانب المفتوح من القنوات. قطع ورقة السيليكون عموديا على القنوات إلى شرائح ثلاثة ملليمترات باستخدام مقص نظيف. ضع كل شريط في مظروف من رقائق الألومنيوم وأغلقه بشريط الأوتوكلاف.
الأوتوكلاف الشرائط على حرارة 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل تخزينها حتى الحاجة. لتعقيم البذور وتقطيعها ، خذ ملليلترا واحدا من محلول التبييض بنسبة 50٪ يحتوي على 0.1٪ Tween 20 في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر وقم بتعليق ما يصل إلى 100 بذرة أرابيدوبسيس فيه. احتضان تعليق البذور في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس إلى 10 دقائق.
بعد الحضانة ، نضح أو ماصة من محلول التبييض تحت ظروف معقمة. شطف البذور مع ملليلتر واحد من الماء المقطر المعقم. تأكد من قلب الأنابيب بشكل كاف أثناء شطف البذور.
لإزالة أي محلول مبيض متبقي في الجزء العلوي من الأنبوب ، كرر الشطف أربع مرات. اترك ما يقرب من 250 ميكرولترا من الماء مع البذور في الأنبوب ، وقم بتخزين البذور في الظلام عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاثة أيام. بعد ذلك ، قبل طلاء البذور ، ضع الشرائط المعقمة على سطح لوحة MS المحضرة لتوجيه محاذاة البذور مع القنوات الموجودة على الشرائط.
بعد ذلك ، عند العمل في ظل ظروف معقمة ، استخدم طرف ماصة سعة 20 ميكرولتر لشفط ونقل العدد المناسب من البذور المحضرة إلى اللوحة. بمجرد طلاء البذور ، قم بإزالة الشرائط المعقمة. تغطية اللوحة.
وختم أحد جوانب اللوحة بالتوازي مع صفوف البذور مع parafilm. لف شريطا قابلا للتنفس أعلى البارافيلم وحول جميع الحواف الأخرى للوحة للسماح بتبادل الهواء أثناء الحضانة. قم بتوجيه لوحين بعناية عموديا بحيث تكون جوانبهما محكمة الغلق متجهة لأسفل.
افصلها في الأسفل عن طريق وضع أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر أفقيا بينهما ، مع تثبيتها معا في الأعلى بشريط مطاطي. تأكد من أن أسطح الألواح تشكل زاوية من 100 إلى 110 مع سطح الطاولة. قم بتخزين الألواح في هذا الاتجاه لمدة 72 ساعة في ظلام دامس عند 21 درجة مئوية للسماح لشتلات hypocotyls بالنمو بطول حوالي خمسة ملليمترات.
بعد ذلك ، قم بإزالة الإعداد من الظلام واحتفظ به تحت ضوء لمدة 16 ساعة ودورة مظلمة لمدة ثماني ساعات لمدة يومين إلى أربعة أيام في نفس درجة الحرارة قبل التطعيم. تطعيم الشتلات بين خمسة وسبعة أيام بعد طلائها. ضع شريط تطعيم فوق الشتلات ، وقم بتركيب hypocotyls في القنوات.
ضع الشتلات برفق ، بحيث يبقى تقاطع الجذر hypocotyl في الجزء السفلي من شريط السيليكون لإعداد الشتلات للتقطيع. العمل في غطاء معقم بمساعدة منظار التشريح ، وإعداد السليل للتطعيم. باستخدام شفرة مشرط جديدة ، قم بعمل قطع مستقيم ونظيف وعمودي عبر hypocotyl.
تجنب الضغط لأسفل ودفع الشتلات إلى أجار. بعد ذلك ، قم بإزالة المزلق وحافظ على رطوبة الجزء المقطوع من المزلق من خلال ضمان ملامسة سطح الوسائط. بدلا من ذلك ، يمكن نقل المزلق إلى طبق بتري مملوء بالماء المقطر المعقم.
لتحضير الجذور ، أمسك الجذر بعناية داخل الفراغ بين الملقط المغلق واستدر برفق لسحبه ، تاركا القسم المقطوع من الجذور في منتصف الشريط. بعد ذلك ، التقط المزلق المطلوب برفق باستخدام الملقط ذي الرؤوس الدقيقة وأدخله في الجزء العلوي من القناة. بصريا ، تأكد من الاتصال بين السليل والطعم الجذري للحصول على طعم ناجح.
بعد إجراء جميع الطعوم ، لف الألواح بشريط بارافيلم وشريط مسامي ، وقم بإعداد الألواح بنفس الطريقة الموضحة من قبل دون إزعاج الشتلات أو شرائط السيليكون. انقل الألواح بعناية إلى غرفة نمو مضبوطة على 26 درجة مئوية مع إضاءة لمدة 16 ساعة ودورة مظلمة لمدة ثماني ساعات. بعد سبعة إلى 10 أيام ، قم بتقييم الشتلات المطعمة في ظروف معقمة باستخدام ملقط لتقشير شريط السيليكون بعناية من جانب واحد وتحرير الشتلات من القنوات.
قم بإزالة أي جذور عرضية تنمو من السليل عن طريق قطعها بشفرة مشرط جديدة أو سحقها بملقط رفيع الرأس. مرة أخرى ، قم بتقييم ما إذا كان الجذر قد أصبح مرتبطا بقوة بالسليل الذي يشكل طعما ناجحا. انقل الطعوم الناجحة إلى تربة تكاثر الشتلات وقم بتغطية التربة بالبلاستيك الشفاف لبضعة أيام أثناء إنشاء الشتلات.
اسمح للنباتات بالنمو تحت دورات الضوء والظلام المذكورة سابقا عند 21 درجة مئوية. كشفت تجارب التطعيم لتحديد بروتوكول التطعيم الأمثل عن معدل نجاح إجمالي في التطعيم بنسبة 25٪ عندما نبتت البذور مباشرة على شرائط السيليكون ذات القنوات المغلقة. أدت إعادة توجيه البذور للحفاظ على الفلقات في الأجنة والإشارة الجذرية إلى أسفل أثناء الإنبات إلى زيادة طفيفة في كفاءة التطعيم إلى 33٪ عند إزالة إغلاق السيليكون على القنوات للسماح بالتلامس بين البذور ووسط النمو ، نبتت 85٪ من الشتلات بنجاح.
ومع ذلك ، ظل معدل نجاح التطعيم عند 31٪مما يشير إلى أنه لا يمكن تحقيق النمو الأمثل للشتلات من خلال الإنبات على الشريط. ومن المثير للاهتمام أن البروتوكول الموضح الذي زرعت فيه الشتلات عموديا على صفيحة التطعيم قبل إدخالها في القنوات المفتوحة في الشرائط أسفر عن معدل نجاح إجمالي في التطعيم إلى 48٪ خلال التجربتين الأوليين. بالنظر إلى انخفاض معدل نجاح التجربة الثالثة والصغيرة نسبيا ، والتي يمكن أن تعزى إلى الاختلافات الطفيفة في مواقع التطعيم ، وجد أن نجاح التطعيم الإجمالي هو 45٪ وهذا مشابه للطريقة التي زرعت فيها الشتلات على ألواح أفقية ، وقطعت على سطح صلب ، ودخلت في شرائط التطعيم.
ومع ذلك ، فإن البروتوكول الموضح أقل استهلاكا للوقت نسبيا. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن للمختبرات الجديدة في تطعيم الشتلات إنشاء أعداد كبيرة من أجهزة دعم التطعيم بسرعة مع القدرة على تخصيص الجهاز ليناسب احتياجاتهم الخاصة بسهولة.
