JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом методе мы количественно связываем связывающее сродство связывающих белков РНК (RBPs) к cognate и неcognate связывающих сайтов с помощью простой, живой, репортер анализ в бактериальных клетках. Ассем основан на подавлении гена репортера.

Аннотация

В шаге начала перевода протеина, ribosome связывает к зоне начала mRNA. Инициация перевода может быть заблокирована путем привязки связывающего белка РНК (RBP) к области инициации мРНК, которая мешает рибосомной связывания. В представленном методе мы используем это блокирующее явление для количественной оценки связывающей близости РБП к их cognate и не-cognate связывающих сайтов. Для этого мы вставляем тестовый узел связывания в область инициации репортера mRNA и индуцируем выражение теста RBP. В случае связывания RBP-РНК мы наблюдали сигмоидальные репрессии в отношении выражения репортера как функции концентрации РБП. В случае несродности или очень низкого сродства между связывающим сайтом и РБП не наблюдалось никаких существенных репрессий. Метод проводится в живых бактериальных клетках и не требует дорогостоящего или сложного оборудования. Это полезно для количественной оценки и сравнения связывающих сходств различных RBPs, которые функционируют в бактериях, чтобы набор разработанных мест связывания. Этот метод может быть неподходящим для связывающих сайтов с высокой структурной сложностью. Это должно к возможности репрессии ribosomal инициации сложной структурой mRNA в отсутствии RBP, которое привело бы к в более низком базальном экспрессии гена репортера, и таким образом более менее-наблюдаемых репрессиях репортера на связывании RBP.

Введение

В последние десятилетия широко изучалась регулировка после транскрипционного регулирования, основанного на РНК-связывающем белке (RBP), в частности, характеристика взаимодействия между РСП и РНК. Есть несколько примеров переводного вниз регулирования бактерий, происходящих из RBPs ингибирования, или непосредственно конкурировать с, рибосома связывания1,2,3. В области синтетической биологии, RBP-РНК взаимодействия становятся важным инструментом для разработки транскрипции на основе генетических схем4,5. Таким образом, растет спрос на характеристику таких взаимодействий RBP-RNA в клеточном контексте.

Наиболее распространенными методами для изучения белково-РНК взаимодействий являются электрофоретические передвижные переплет анализа (EMSA)6, который ограничивается в настройках пробирки, и различные выдвижные анализы7, в том числе метод CLIP8,9 . Хотя такие методы позволяют обнаружить de novo РНК связывания сайтов, они страдают от недостатков, таких как трудоемкие протоколы и дорогие глубокие реакции секвенирования и может потребовать конкретного антитела для вытягивания RBP. Из-за восприимчивого характера РНК к окружающей среде, многие факторы могут повлиять на взаимодействие RBP-РНК, подчеркивая важность допроса РБП-РНК связывания в клеточном контексте. Например, мы и другие продемонстрировали значительные различия между структурами РНК in vivo и in vitro10,11.

Основываясь на подходе предыдущего исследования12, мы недавно продемонстрировали10, что при размещении предварительно разработанных обязательных сайтов для капсида RBPs от бактериофагов GA13, MS214, PP7,иNo 16 в перевод инициации области репортера мРНК, репортер выражение сильно репрессированных. Мы представляем относительно простой и количественный метод, основанный на этом феномене репрессий, для измерения сродства между RBPs и их соответствующим ими связывающим сайтом РНКs in vivo.

протокол

1. Подготовка системы

  1. Дизайн обязательно-участок плазмиды
    1. Дизайн связывающей кассеты сайта, как показано на рисунке 1. Каждый миниген содержит следующие части (5' до 3'): Место ограничения Eagl, 40 оснований 5' конца гена сопротивления канамицина (Кан), промоутер pLac-Ara, место связывания рибосом (RBS), AUG гена mCherry, прокладка (я), место связывания RBP, 80 оснований 5' конца гена mCherry и места ограничения ApaLI.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы увеличить частоту асссея, разработай три связывающих кассеты для каждого связывающего участка, с помощью прокладок, состоящих по крайней мере из одной, двух и трех баз. Дополнительные рекомендации по результатам работы с представителями.
  2. Клонирование связывающих площадок сайта
    1. Закажите связывающие кассеты в виде двухцепочечных минигенов ДНК (dsDNA). Каждый миниген имеет длину 500 б.п. и содержит место ограничения Eagl и место ограничения ApaLI на концах 5' и 3', соответственно (см. шаг 1.1.1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте, мини-гены с половиной гена канамицина было приказано облегчить скрининг для положительных колоний. Тем не менее, Гибсон сборки17 также подходит здесь, и в этом случае связывание сайт может быть заказан в качестве двух коротких дополнительных одноцепочечных олигоДНК ДНК.
    2. Двойной переваривание как мини-генов и целевой вектор с Eagl-HF и ApaLI по протоколу ограничения18, и столбец очистить19.
    3. Ligate переваренных minigenes к связывающей-сайт позвоночника, содержащего остальную часть гена репортера mCherry, терминатор, и ген анамицин устойчивости20.
    4. Преобразуйте раствор перевязки в клетки Escherichia coli TOP1021.
    5. Определите положительные трансформанты с помощью секвенирования Sanger.
      1. Дизайн грунтовки 100 баз вверх по течению к региону интереса (см. таблицу 1 для грунтовых последовательностей).
      2. Miniprep несколько бактериальных колоний22.
      3. Приготовьте 5 мкм раствора грунтовки и 10 л ДНК при концентрации 80 нг/Л.
      4. Отправить два решения на удобный объект для Секне секвенирования23.
    6. Храните очищенные плазмиды при -20 градусах по Цельсию, а также бактериальные штаммы в виде глицерола24,как в 96-хорошем формате. ЗАТЕМ ДНК будет использоваться для преобразования в клетки E. coli TOP10, содержащие одну из четырех плазмид слияния-RBP (см. шаг 1.3.5).
  3. Проектирование и строительство плазмида РБП
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аминокислоты и нуклеотидные последовательности белков пальто, используемых в этом исследовании, перечислены в таблице 2.
    1. Заказать требуемую последовательность RBP не хватает остановки кодон как заказ dsDNA minigene не хватает остановки кодон с ограничения сайтов на концах (Рисунок 1).
    2. Клон испытания RBP не хватает остановки кодон сразу вниз по течению индуцируемых промоутер и вверх по течению флуоресцентного белка не хватает начала кодон (Рисунок 1), похож на шаги 1.2.2-1.2.4. Убедитесь, что плазмида RBP содержит другой ген устойчивости к антибиотикам, чем обязательная плазмида.
    3. Определите положительные трансформанты с помощью секвенирования Sanger, аналогичного шагу 1.2.5 (см. таблицу 1 для последовательностей грунтовки).
    4. Выберите один положительный трансформатор и сделать его химически компетентным25. Хранить в качестве глицерола очищенные плазмиды при -20 градусах по Цельсию и глицерол запасы бактериальных штаммов24 при -80 градусах По цельсию в 96-колодцах пластин.
    5. Преобразуйте пласмиды связывающего участка (от шага 1.2.6), хранящиеся в 96-колодцах, в химически компетентные бактериальные клетки, уже содержащие плазмид RBP-mCerulean21. Чтобы сэкономить время, вместо того, чтобы накрывать клетки на чашках Петри, наклеиваем их на 8-канальный пипетки на 8-полосные тарелки, содержащие Лурию-Бертани (LB)26 агар агар агар асоответствующих антибиотиков (Kan и Amp). Колонии должны появиться в 16 ч.
    6. Выберите одну колонию для каждого двойного трансформанта и расти на ночь в среде LB с соответствующими антибиотиками (Кан и Amp) и хранить как глицерол запасов24 при -80 градусов по Цельсию в 96-колодцепластины.

2. Эксперимент настройки

ПРИМЕЧАНИЕ: Представленный здесь протокол был выполнен с использованием робототехнической системы обработки жидкостей в сочетании с инкубатором и считывателем пластин. Каждое измерение проводилось для 24 концентраций индуктора, с двумя дубликатами для каждого штамма и индуктора комбинации. С помощью этой роботизированной системы были собраны данные по 16 штаммам в день с 24 концентрациями индуктора. Однако, если такое устройство недоступно, или если требуется меньше экспериментов, их можно легко сделать вручную с помощью 8-канальной мультипипетки и соответствующим образом адаптировать протокол. Например, таким образом были получены предварительные результаты по четырем штаммам в день с 12 концентрациями индуктора и четырьмя тайм-пойнтами.

  1. Приготовьте заранее 1 л биоасса-буфера (BA) путем смешивания 0,5 г триптона, 0,3 мл глицерола, 5,8 г NaCl, 50 мл 1 M MgSO4, 1 мл 10x фосфат-буферный солен (PBS) буфер рН 7,4 и 950 мл двойной дистиллированной воды (DD). Автоклав или стерильный фильтр буфер BA.
  2. Выращивайте двойные трансформанты при 37 градусах Цельсия и 250 об/мин, встряхивая в 1,5 мл ЛТ с соответствующими антибиотиками (канамицин при конечной концентрации 25 мкг/мл и ампициллин при конечной концентрации 100 мкг/мл), в 48-ну колодцев, в течение 18 л.с.
  3. Утром сделайте следующие приготовления.
    1. Индуктора пластины. В чистой 96-хорошо пластины, подготовить скважины с полубедной среде (SPM), состоящей из 95% BA и 5% LB26 в инкубаторе при 37 градусов по Цельсию. Количество скважин соответствует желаемому количеству концентраций индуктора. Добавьте C4-HSL к скважинам в пластине индуктора, которая будет содержать самую высокую концентрацию индуктора (218 нм).
    2. Программа робота, чтобы последовательно разбавить среду от каждой из скважин с высокой концентрацией в 23 нижних концентраций, начиная от 0 до 218 нм. Объем разбавления каждого индуктора должен быть достаточным для всех штаммов (включая дубликаты).
    3. В то время как разбавления индуктора готовятся, тепло 180 л SPM в инкубаторе при 37 градусах Цельсия, в 96-колодцах пластин.
    4. Разбавить ночные штаммы со ступени 2,2 в 100 раз серийными разбавлениями: сначала разбавить в 10 раз, смешивая 100 л бактерий с 900 л SPM в 48-ну хорошо пластины, а затем разбавить снова в 10 раз, взяв 20 qL от разбавленного раствора в 180 л предварительно разогретого SPM, в 96-хорошо пластин, пригодных для флуоресцентных измерений.
    5. Добавьте разбавленный индуктор из индуктора в 96-колодцы пластины с разбавленными штаммами в соответствии с окончательными концентрациями.
  4. Встряхните 96-колодственные пластины при температуре 37 градусов по Цельсию на 6 ч, при измерении оптической плотности на уровне 595 нм (OD595),mCherry (560 нм/612 нм) и mCerulean (460 нм/510 нм) флуоресценции через плиту читателя каждые 30 минут. Для целей нормализации измеряйте рост СМП без добавления ячеек.

3. Предварительный анализ результатов

  1. Для каждого дня эксперимента выбирайте временной интервал логарифмического роста в соответствии с измеренными кривыми роста, между фазой линейного роста и стационарной (T0, Tfinal). Возьмите примерно 6-8 временных точек, отбрасывая первые и последние измерения, чтобы избежать погрешности, полученной из неточности экспоненциального обнаружения роста (см. рисунок 2A, верхняя панель).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Откажитесь от штаммов, которые показывают аномальные кривые роста или штаммы, где логарифмическая фаза роста не может быть обнаружена, и повторите эксперимент.
  2. Рассчитайте среднюю нормализованную флуоресценцию мцерулеана и скорость производства mCherry, из необработанных данных как mCerulean, так и mCherry флуоресценции для каждой концентрации индуктора(рисунок 2A).
    1. Рассчитайте нормализованный mCerulean следующим образом:
      figure-protocol-8943
      где пустой (mCerulean) является mCerulean уровнем (a.u.) для среднего только, пустой (OD) является оптическая плотность только для среднего только, и mCerulean и OD являются mCerulean флуоресценции и оптической плотности значения, соответственно.
    2. Средний mCerulean над различными точками времени(рисунок 2B, верхние 2 панели) следующим образом:
      figure-protocol-9401
      где #Time точками является количество данных тайм-точек, принятых во внимание, T0 это время, в котором начинается экспоненциальная фаза роста, и Tfinal это время, в котором экспоненциальная фаза роста заканчивается.
    3. Рассчитайте скорость производства mCherry(рисунок 2B,две нижние панели) следующим образом:
      figure-protocol-9843
      где mCherry(t) является уровнем mCherry в то время т, OD является значением оптической плотности, T0 это время, в котором начинается экспоненциальная фаза роста, а Tfinal – это время, в которое заканчивается экспоненциальная фаза роста.
  3. Наконец, участок mCherry скорость производства в качестве функции mCerulean, создавая кривые реакции дозы в качестве функции RBP-mCerulean фьюжн(Рисунок 2C). Такие участки представляют собой производство гена репортера как функцию присутствия RBP в клетке.

4. Функция реагирования дозы Fitting Routine и KRBP Extraction

  1. Исходя из предположения, что рибосомная скорость перевода с привязанной РБП постоянна, моделируйте скорость производства mCherry следующим образом (см. рисунок 2D,зеленая линия):
    figure-protocol-10811
    где «x» является нормализованной средней мцерулеановой флуоресценции, рассчитанной в соответствии с Eq. 2, скорость производства mCherry является значением, рассчитанным в соответствии с Eq. 3, KRBP является относительной связывающей сродством ,a.u.), Kunbound является рибосомной скоростью перевод с RBP несвязанным, n является фактором куперативности, а C является базовой флуоресценцией .u. C, n, Kunboundи KRBP можно найти, приспосабливая данные о скорости производства mCherry к модели (Eq. 4).
  2. С помощью программного обеспечения для анализа данных, провести установку процедуры на участках, изображающих скорость производства mCherry в качестве функции усредненного mCerulean (шаг 3.3), и извлечь соответствующие параметры в соответствии с формулой в Eq. 4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Учитываются только соответствующие результаты с R2 и 0,6. Для тех, кто подходит, KRBP ошибка в основном в диапазоне от 0,5% до 20% от KRBP значения, для 0,67 доверительный интервал, в то время как те, с более высокой kRBP ошибка может быть также проверена глазом.
  3. Нормализовать значения KRBP по соответствующей максимальной стоимости усреднения mCerulean для каждой функции реакции дозы.
    figure-protocol-12186
    где KRBP в «a.u.» — это значение, извлеченное из процедуры установки в Eq. 4, а макс (средний mCerulean) — это максимальный усредненный mCerulean сигнал «a.u», наблюдаемый для текущего штамма.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нормализация облегчает правильное сравнение регулирующего эффекта между штаммами, устраняя зависимость от конкретных максимальных уровней выражения RBP.

Результаты

Представленный метод использует конкуренцию между RBP и ribosome для связывать к молекуле мРНК (рисунок1). Эта конкуренция находит свое отражение в снижении уровня mCherry как функции увеличения производства RBP-mCerulean, в связи с увеличением концентрации индуктор...

Обсуждение

Метод, описанный в этой статье, облегчает количественное измерение связывания СВЯЗывающей РБП-РНК в клетках кишечной палочки. Протокол относительно прост и может быть проведен без использования сложного оборудования, а анализ данных прост. Кроме того, результаты получаются сразу...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Этот проект получил финансирование от Программы I-CORE Комитета по планированию и бюджетированию и Израильского научного фонда (Грант No 152/11), Гранта Марии Кюри по вопросам реинтеграции No. PCIG11-GA- 2012-321675, а также из программы исследований и инноваций Европейского союза Horizon 2020 по грантовому соглашению No 664918 - MRG-Grammar.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Ampicillin sodium saltSIGMAA9518
Magnesium sulfate (MgSO4)ALFA AESAR33337
48 platesAxygenP-5ML-48-C-S
8-lane platesAxygenRESMW8I
96-well platesAxygenP-DW-20-C
96-well plates for plate readerPerkin Elmer6005029
ApaLINEBR0507
Binding site sequencesGen9 Inc. and Twist Biosciencesee Table 1
E. coli TOP10 cellsInvitrogenC404006
Eagl-HFNEBR3505
GlycerolBIO LAB071205
IncubatorTECANliconic incubator
Kanamycin solfateSIGMAK4000
KpnI- HFNEBR0142
LigaseNEBB0202S
Liquid-handling robotic systemTECANEVO 100, MCA 96-channel
Matlab analysis softwareMathworks
Multi- pipette 8 lanesAxygenBR703710
N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL)caymanK40982552 019
PBS bufferBiological Industries020235A
PlatereaderTECANInfinite F200 PRO
Q5 HotStart PolymeraseNEBM0493
RBP seqeuncesAddgene27121 & 40650see Table 2
Sodium Chloride (NaCL)BIO LAB190305
SV Gel and PCR Clean-Up SystemPromegaA9281
TryptoneBD211705

Ссылки

  1. Cerretti, D. P., Mattheakis, L. C., Kearney, K. R., Vu, L., Nomura, M. Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein. Journal of Molecular Biology. 204 (2), 309-329 (1988).
  2. Babitzke, P., Baker, C. S., Romeo, T. Regulation of translation initiation by RNA binding proteins. Annual Review of Microbiology. 63, 27-44 (2009).
  3. Van Assche, E., Van Puyvelde, S., Vanderleyden, J., Steenackers, H. P. RNA-binding proteins involved in post-transcriptional regulation in bacteria. Frontiers in Microbiology. 6, 141 (2015).
  4. Chappell, J., Watters, K. E., Takahashi, M. K., Lucks, J. B. A renaissance in RNA synthetic biology: new mechanisms, applications and tools for the future. Current Opinion in Chemical Biology. 28, 47-56 (2015).
  5. Wagner, T. E., et al. Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043 (2018).
  6. Bendak, K., et al. A rapid method for assessing the RNA-binding potential of a protein. Nucleic Acids Research. 40 (14), e105 (2012).
  7. Strein, C., Alleaume, A. -. M., Rothbauer, U., Hentze, M. W., Castello, A. A versatile assay for RNA-binding proteins in living cells. RNA. 20 (5), 721-731 (2014).
  8. Ule, J., Jensen, K. B., Ruggiu, M., Mele, A., Ule, A., Darnell, R. B. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).
  9. Lee, F. C. Y., Ule, J. Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions. Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).
  10. Katz, N., et al. An in Vivo Binding Assay for RNA-Binding Proteins Based on Repression of a Reporter Gene. ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2765-2774 (2018).
  11. Watters, K. E., Yu, A. M., Strobel, E. J., Settle, A. H., Lucks, J. B. Characterizing RNA structures in vitro and in vivo with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Methods. 103, 34-48 (2016).
  12. Saito, H., et al. Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch. Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).
  13. Gott, J. M., Wilhelm, L. J., Uhlenbeck, O. C. RNA binding properties of the coat protein from bacteriophage GA. Nucleic Acids Research. 19 (23), 6499-6503 (1991).
  14. Peabody, D. S. The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein. The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).
  15. Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
  16. Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. The RNA-binding Site of Bacteriophage Qβ Coat Protein. Journal of Biological Chemistry. 271 (50), 31839-31845 (1996).
  17. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  18. . Optimizing Restriction Endonuclease Reactions Available from: https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions (2018)
  19. . Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System Protocol Available from: https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/ (2018)
  20. . Ligation Protocol with T4 DNA Ligase (M0202) Available from: https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202 (2018)
  21. . Routine Cloning Using Top10 Competent Cells - US Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html (2018)
  22. . NucleoSpin Plasmid - plasmid Miniprep kit Available from: https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx (2018)
  23. Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
  24. . Protocol - How to Create a Bacterial Glycerol Stock Available from: https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/ (2018)
  25. . Making your own chemically competent cells Available from: https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells (2018)
  26. . Luria-Bertani (LB) Medium Preparation · Benchling Available from: https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation (2018)
  27. Delebecque, C. J., Silver, P. A., Lindner, A. B. Designing and using RNA scaffolds to assemble proteins in vivo. Nature Protocols. 7 (10), 1797-1807 (2012).
  28. Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nature Methods. 10 (2), 119-121 (2013).
  29. Espah Borujeni, A., et al. Precise quantification of translation inhibition by mRNA structures that overlap with the ribosomal footprint in N-terminal coding sequences. Nucleic Acids Research. 45 (9), 5437-5448 (2017).
  30. Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505, (2013).
  31. Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
  32. Lucks, J. B., et al. Multiplexed RNA structure characterization with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11063-11068 (2011).
  33. Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486 (2015).
  34. Watters, K. E., Abbott, T. R., Lucks, J. B. Simultaneous characterization of cellular RNA structure and function with in-cell SHAPE-Seq. Nucleic Acids Research. 44 (2), e12 (2016).
  35. Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11 (2), 273-290 (2016).
  36. Bernardi, A., Spahr, P. -. F. Nucleotide Sequence at the Binding Site for Coat Protein on RNA of Bacteriophage R17. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10), 3033-3037 (1972).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

148RBPMS2PP7RBPRBP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены