Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
В данной статье описаны экспериментальные процедуры для (а) истощения U1 snRNP из ядерных экстрактов с сопутствующей потерей сплайсинговой активности; и (b) восстановление сплайсинговой активности в U1-обедненном экстракте частицами snRNP галектина-3-U1, связанными с ковалентно связанными с анти-галектин-3 антителами.
Классические эксперименты по истощению-восстановлению показывают, что галектин-3 является обязательным фактором сплайсинга в ядерных экстрактах. Механизм включения галектина-3 в сплайсинговый путь рассматривается в данной работе. Осаждение клеточных ядерных экстрактов HeLa на 12%-32% градиентах глицерина дает фракции, обогащенные эндогенной частицей ~10S, содержащей галектин-3 и U1 snRNP. Теперь мы описываем протокол для истощения ядерных экстрактов U1 snRNP с сопутствующей потерей сплайсинговой активности. Сплайсинговая активность в U1-истощенном экстракте может быть восстановлена частицей snRNP галектина-3 - U1, захваченной на бусинах агарозы, ковалентно связанной с антителами против галектина-3. Результаты показывают, что троичный комплекс галектин-3 - U1 snRNP - пре-мРНК является функциональным комплексом Е, приводящим к промежуточным продуктам и продуктам реакции сплайсинга, и что галектин-3 попадает в путь сплайсинга через его ассоциацию с U1 snRNP. Схема использования комплексов аффинно- или иммуно-, выбранных на шариках, для восстановления сплайсинговой активности в экстрактах, обедненных специфическим фактором сплайсинга, может быть в целом применима к другим системам.
Производство большинства эукариотических мессенджерных РНК (мРНК) включает удаление интронов и лигирование экзонов в ядерном процессе, называемом сплайсингом премрнК1. Два класса РНК-белковых комплексов (RNP) направляют обработку пре-мессенджерной РНК в зрелую мРНК через сплайсеосомальные комплексы. Один класс, зарождающиеся предмаршированные RNP, образуется котранскрипционно путем связывания гетерогенных ядерных белков RNP и других РНК-связывающих белков, включая некоторых членов семейства SR, давая комплексы hnRNP2. Второй класс, богатый урацилом малые ядерные RNP (U snRNP с U1, U2, U4, U5 и U6 snRNAs) связан с U-специфическими и основными белками3,4. U snRNP взаимодействуют упорядоченным образом с определенными областями предмарш-мессенджерных RNP в динамическом пути ремоделирования, поскольку интроны иссекаются, а экзоны лигируются для получения зрелых mRNPs5. Многие дополнительные ядерные белки участвуют в этих событиях обработки6.
Галектин-1 (Gal1) и галектин-3 (Gal3) являются двумя белками, которые являются необходимыми факторами в пути сплайсинга, как показано исследованиями истощения-восстановления7,8. Удаление обоих галектинов из сращивания компетентных ядерных экстрактов (NE) отменяет сплайсеосомную сборку и сплайсинговую деятельность на ранней стадии. Добавление любого галектина к такому вдвойне истощенному NE восстанавливает обе активности. Gal1 и Gal3 являются компонентами активных сплайсеосом, о чем свидетельствует специфическая иммунопреципитация пре-мРНК, сплайсинговых промежуточных продуктов и зрелой мРНК антисывороткой, специфичной для Gal1 или Gal39. Важно отметить, что Gal3 ассоциируется с эндогенной U snRNA, содержащей частицы в NE вне пути сплайсинга, как показано осаждением snRNP анти-Gal3 antisera10. Наконец, глушение Gal3 в клетках HeLa изменяет паттерны сплайсинга многочисленных генов11.
В NE, предварительно инкубированном для разборки предварительно сформированных сплайсеосом12, snRNP обнаруживаются в нескольких комплексах, осажденных в градиентах глицерина от 7S до более 60S. Хотя фракционирование градиента глицерина является распространенным методом выделения сплайсеосомальных комплексов и компонентов (см., например, ссылки13,14,15), мы расширили этот метод, охарактеризовав специфические фракции с использованием иммунопреципитаций антител. SnRNP осадок при 10S содержит только U1 snRNA вместе с Gal3. Иммунопреципитация фракции 10S с антисыворотки, специфичной для Gal3 или U1 snRNP, осаждает как U1, так и Gal3, указывая на то, что некоторые из моночастиц U1 snRNP связаны с Gal310. Поскольку U1 snRNP является первым комплексом, который связывается с pre-mRNP в сплайсеосомальной сборке1,5, этот шаг представляет собой потенциальный входной участок для Gal3 в путь сплайсинга. На этой основе мы показали, что моночастицы 10S Gal3-U1 snRNP, связанные с бусинами, содержащими анти-Gal3, восстанавливают активность сплайсинга к U1 snRNP истощенной NE, устанавливая этот комплекс как один механизм, с помощью которого Gal3 набирается в сплайсеосомальный путь16. Это контрастирует с попытками выделения сплайсеосом на определенных этапах реакции сплайсинга и каталогизации связанных с ними факторов17,18. В таких исследованиях констатируется наличие определенных факторов в какой-то момент времени, но не механизм, с помощью которого они были загружены.
Ранее мы подробно описали подготовку NE, сплайсинговую подложку, сборку реакционной смеси сплайсинга и анализ продуктов в нашей документации о роли галектинов в сплайсинге премрнК19. Теперь описаны экспериментальные процедуры фракционирования ядерных экстрактов для получения фракции, обогащенной комплексом SnRNP Gal3 - U1, и иммуноотбора последнего комплекса для восстановления сплайсинговой активности в ядерном экстракте, обедненном U1.
Рисунок 1: Принципиальная диаграмма, иллюстрирующая дополнение сплайсинговой активности в ядерном экстракте, обедненном U1 snRNP комплексом Gal3-U1 snRNP на шариках. (A) NE в буфере C (NE(C)) инкубируют с белком A-Sepharose бусинами, ковалентно связанными с анти-U1 snRNP (бусины αU1). Несвязанная фракция обедняется U1 snRNP (U1ΔNE). (B) NE в буфере D (NE(D)) фракционируют по 12%-32% градиенту глицерина путем ультрацентрифугирования. Фракции, соответствующие области 10S (фракции 3-5), объединяют и смешивают с бусинами, ковалентно связанными с антителами против Gal3 (шарики αGal3). Материал, связанный с шариками, содержит моночастицу Gal3-U1 snRNP. (C) Комплекс SnRNP Gal3-U1 из части (B) смешивают с U1ΔNE из части (A) в сплайсинговом анализе с использованием 32P-меченого субстрата MINX pre-mRNA, а промежуточные продукты и продукты реакции сплайсинга анализируют с помощью гелевого электрофореза и ауторадиографии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
1. Примечания по общим процедурам
Имя буфера | Состав |
Боратный буфер | 0,2 М бората натрия, рН 9 |
Буфер C | 20 мМ HEPES, рН 7,9, 25% (об./об.) глицерин, 0,42 М NaCl, 1,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ ЭДТА, 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF), 0,5 мМ дитиотрейтол (DTT) |
Буфер D | 10 мМ HEPES, рН 7,9, 20% (об./об.) глицерин, 0,1 М KCl, 0,2 мМ ЭДТА, 0,5 мМ PMSF, 0,5 мМ DTT |
60%Д | 60% буфер D и 40% H2O |
Этаноламин | 0,2 М этаноламина, рН 8 |
Буфер связывания HEPES | 20 мМ HEPES, рН 7,9 |
Буфер для промывки HEPES | 20 мМ HEPES, рН 7,9, 0,5 М NaCl |
Буфер загрузки РНК | 90% формамид, 20 мМ ЭДТА, рН 8, 0,05% (мас./об.) бромфенола синего |
Буфер SDS-PAGE | 25 мМ Tris, глицин 169 мМ, 0,1% додецилсульфата натрия (SDS), рН 8,8 |
Буфер образцов SDS | 62,5 мМ Tris, pH 6,8, 2% SDS, 10% глицерин, 5% 2-меркаптоэтанол, 0,1% (мас./об.) бромфенол-синий |
Буфер TBE для РНК-гелей | 89 мМ Tris, борная кислота 89 мМ, ЭДТА 2,5 мМ, рН 8,3 |
Буфер TE | 10 мМ Трис, рН 8, 1 мМ ЭДТА |
Буфер передачи | 25 мМ Tris, 1,92 М глицина, 20% метанола, рН 8,3 |
Буфер T-TBS | 10 мМ Tris, 0,5 М NaCl, 0,05% анимации 20, рН 7,5 |
TX буфер промывки | 0,05% Тритон X-100 (TX) в 60% D |
Таблица 1: Название и состав буферов
2. Препарат NE истощен U1 snRNP (U1 ΔNE)
3. Иммунопреципитация 10S фракций градиентов глицерина анти-Gal3
4. Сборка реакции сращивания и анализ продуктов
NE, обедненные комплексами U1 snRNP (U1ΔNE из раздела 2.2.6) и Gal3 - U1 snRNP из области 10S градиента глицерина, иммунопреципитированного анти-Gal3 (стадия 3.2.7), смешивали в реакции сплайсинга. Эта реакционная смесь содержала u1 snRNA (рисунок 2A, полоса 3), а также U1-специфичес?...
В этом отчете представлены экспериментальные детали, которые документируют комплекс Gal3 - U1 snRNP, захваченный на бусинах, покрытых анти-Gal3, может связываться с субстратом пре-мРНК, и этот троичный комплекс может восстанавливать активность сплайсинга к обедненному U1 snRNP NE. Gal3 является одни?...
Авторам нечего раскрывать.
Эта работа была поддержана грантом Национального научного фонда MCB-0092919 и грантом Мичиганского государственного университета 09-CDFP-2001 (для RJP) и грантом Национальных институтов здравоохранения GM-38740 и Мичиганским agBioResearch Project MICL02455 (для JLW).
Субстрат MINX пре-мРНК, используемый в анализах сплайсинга, был добрым подарком от доктора Сьюзан Бергет (Медицинский колледж Бейлора, Хьюстон, Техас, США).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
anti-U1 snRNP | The Binding Site | Hu ENA-RNP #33471 | human autoimmune serum specific for U1 snRNP |
bottle top vacuum filter | Fisher Scientific | Corning 431153 (0.22 μm; PES 150 ml) | for filtering solutions containing Tris |
centrifuge | International Equipment Company | IEC Model PR-6 | for pelletting Sepharose beads in immunoprecipitation |
diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 159220-5G | for treatment of water used in preparation of all solutions |
dimethylpimelimidate (DMP) | Sigma-Aldrich | 80490-5G | for cross-linking antibody to Sepharose beads |
electrophoresis cell | BioRad Laboratories, Inc | Mini-Protean II | for SDS-PAGE separation of proteins |
ethanolamine | Sigma-Aldrich | 411000-100ml | for blocking after the cross-linking reaction |
gel electrophoresis system | Hoefer, Inc | HSI SE 500 Series | for separating snRNAs by gel electrophoresis |
gel slab dryer | BioRad | Model 224 | for drying gel slabs for autoradiography |
Hybond ECL membrane | GE Healthcare | RPN3032D (0.2 μm; 30 cm x 3 m) | for immunoblotting of proteins on membrane |
microdialyzer (12 x 100 μl sample capacity) | Pierce | Microdialyzer System 100 | for exchanging the buffer of nuclear extract |
microdialyzer membranes (8K cutoff) | Pierce | 66310 | for exchanging the buffer of nuclear extract |
non-fat dry milk | Spartan Stores | Spartan Instant Non-fat Dry Milk | |
Protein A Sepharose CL-4B | Millipore-Sigma | GE 17-0780-01 | for coupling antibody to beads |
Proteinase K | Millipore-Sigma | P2308-5mg | for stopping the splicing reaction to isolate the RNAs |
RNasin | Promega | N2111 | for inhibiting ribonuclease activity |
rocker/rotator | Lab Industries, Inc | Labquake Shaker 400-110 | for mixing protein solutions in coupling reactions and in immunoprecipitation |
Safety-Solve | Research Products International Corp. | No. 111177 | scintillation counting cocktail for determination of radioactivity in splicing substrate |
scintillation counter | Beckman Instruments | LS6000SC | scintillation counter for determination of radioactivity |
speed vaccum concentrator | Savant | SVC 100H | for drying ethanol-precipitated RNA pellets |
Transphor electrophoresis unit | Hoefer, Inc | Hoefer TE Series Transphor | for protein transfer from SDS-PAGE to blotting membrane |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены