Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной статье описаны экспериментальные процедуры для (а) истощения U1 snRNP из ядерных экстрактов с сопутствующей потерей сплайсинговой активности; и (b) восстановление сплайсинговой активности в U1-обедненном экстракте частицами snRNP галектина-3-U1, связанными с ковалентно связанными с анти-галектин-3 антителами.

Аннотация

Классические эксперименты по истощению-восстановлению показывают, что галектин-3 является обязательным фактором сплайсинга в ядерных экстрактах. Механизм включения галектина-3 в сплайсинговый путь рассматривается в данной работе. Осаждение клеточных ядерных экстрактов HeLa на 12%-32% градиентах глицерина дает фракции, обогащенные эндогенной частицей ~10S, содержащей галектин-3 и U1 snRNP. Теперь мы описываем протокол для истощения ядерных экстрактов U1 snRNP с сопутствующей потерей сплайсинговой активности. Сплайсинговая активность в U1-истощенном экстракте может быть восстановлена частицей snRNP галектина-3 - U1, захваченной на бусинах агарозы, ковалентно связанной с антителами против галектина-3. Результаты показывают, что троичный комплекс галектин-3 - U1 snRNP - пре-мРНК является функциональным комплексом Е, приводящим к промежуточным продуктам и продуктам реакции сплайсинга, и что галектин-3 попадает в путь сплайсинга через его ассоциацию с U1 snRNP. Схема использования комплексов аффинно- или иммуно-, выбранных на шариках, для восстановления сплайсинговой активности в экстрактах, обедненных специфическим фактором сплайсинга, может быть в целом применима к другим системам.

Введение

Производство большинства эукариотических мессенджерных РНК (мРНК) включает удаление интронов и лигирование экзонов в ядерном процессе, называемом сплайсингом премрнК1. Два класса РНК-белковых комплексов (RNP) направляют обработку пре-мессенджерной РНК в зрелую мРНК через сплайсеосомальные комплексы. Один класс, зарождающиеся предмаршированные RNP, образуется котранскрипционно путем связывания гетерогенных ядерных белков RNP и других РНК-связывающих белков, включая некоторых членов семейства SR, давая комплексы hnRNP2. Второй класс, богатый урацилом малые ядерные RNP (U snRNP с U1, U2, U4, U5 и U6 snRNAs) связан с U-специ....

протокол

1. Примечания по общим процедурам

  1. Убедитесь, что все химические вещества (буферные компоненты, ферменты и т. д.) не содержат рибонуклеазы (РНКазы). Изолируйте все коммерчески приобретенные бутылки с реагентами от общего лабораторного использования. Надевайте перчатки на все этапы экспериментальной процедуры. Используйте только стеклянную посуду и посуду, которые были запечены (см. шаг 1.2 ниже) и растворы, которые были предварительно обработаны (см. шаг 1.3 ниже).
  2. Выпекайте всю стеклянную посуду (стаканы, колбы, бутылки, пипетки и т.д.) не менее 4 ч при 177 °C. Заверните другую посуду (шпатели, перемешиватели и т.д.) в алюминиевую фольгу перед вып....

Результаты

NE, обедненные комплексами U1 snRNP (U1ΔNE из раздела 2.2.6) и Gal3 - U1 snRNP из области 10S градиента глицерина, иммунопреципитированного анти-Gal3 (стадия 3.2.7), смешивали в реакции сплайсинга. Эта реакционная смесь содержала u1 snRNA (рисунок 2A, полоса 3), а также U1-специфичес?.......

Обсуждение

В этом отчете представлены экспериментальные детали, которые документируют комплекс Gal3 - U1 snRNP, захваченный на бусинах, покрытых анти-Gal3, может связываться с субстратом пре-мРНК, и этот троичный комплекс может восстанавливать активность сплайсинга к обедненному U1 snRNP NE. Gal3 является одни?.......

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом Национального научного фонда MCB-0092919 и грантом Мичиганского государственного университета 09-CDFP-2001 (для RJP) и грантом Национальных институтов здравоохранения GM-38740 и Мичиганским agBioResearch Project MICL02455 (для JLW).

Субстрат MINX пре-мРНК, используемый в анализах сплайсинга, был добрым подарком от доктора Сьюзан Бергет (Медицинский колледж Бейлора, Хьюстон, Техас, США).

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-U1 snRNPThe Binding SiteHu ENA-RNP #33471human autoimmune serum specific for U1 snRNP
bottle top vacuum filterFisher ScientificCorning 431153 (0.22 μm; PES 150 ml)for filtering solutions containing Tris
centrifugeInternational Equipment CompanyIEC Model PR-6for pelletting Sepharose beads in immunoprecipitation
diethylpyrocarbonate (DEPC)Sigma-Aldrich159220-5Gfor treatment of water used in preparation of all solutions
dimethylpimelimidate (DMP)Sigma-Aldrich80490-5Gfor cross-linking antibody to Sepharose beads
electrophoresis cellBioRad Laboratories, IncMini-Protean IIfor SDS-PAGE separation of proteins
ethanolamineSigma-Aldrich411000-100mlfor blocking after the cross-linking reaction
gel electrophoresis systemHoefer, IncHSI SE 500 Seriesfor separating snRNAs by gel electrophoresis
gel slab dryerBioRadModel 224for drying gel slabs for autoradiography
Hybond ECL membraneGE HealthcareRPN3032D (0.2 μm; 30 cm x 3 m)for immunoblotting of proteins on membrane
microdialyzer (12 x 100 μl sample capacity)PierceMicrodialyzer System 100for exchanging the buffer of nuclear extract  
microdialyzer membranes (8K cutoff)Pierce66310for exchanging the buffer of nuclear extract 
non-fat dry milkSpartan StoresSpartan Instant Non-fat Dry Milk
Protein A Sepharose CL-4BMillipore-SigmaGE 17-0780-01for coupling antibody to beads
Proteinase KMillipore-SigmaP2308-5mgfor stopping the splicing reaction to isolate the RNAs
RNasinPromegaN2111for inhibiting ribonuclease activity
rocker/rotatorLab Industries, Inc Labquake Shaker 400-110for mixing protein solutions in coupling reactions and in immunoprecipitation
Safety-SolveResearch Products International Corp.No. 111177scintillation counting cocktail for determination of radioactivity in splicing substrate
scintillation counterBeckman InstrumentsLS6000SCscintillation counter for determination of radioactivity 
speed vaccum concentratorSavantSVC 100Hfor drying ethanol-precipitated RNA pellets
Transphor electrophoresis unitHoefer, IncHoefer TE Series Transphorfor protein transfer from SDS-PAGE to blotting membrane

Ссылки

  1. Hoskins, A. A., Moore, M. J. The spliceosome: a flexible, reversible macromolecular machine. Trends In Biochemical Sciences. 37, 179-188 (2012).
  2. Choi, Y. D., Grabowski, P., Sharp, P. A., Dreyfuss, G. Heterogeneous nuclear ribon....

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

166U1 snRNP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены