Повсеместный и тканеспецифический таргетинг РНК у Drosophila Melanogaster с использованием CRISPR / CasRx

Резюме

В этой статье описывается подробный протокол использования фермента Cas13D, нацеленного на РНК (RfxCas13D) у мух.

Аннотация

CasRx, член семейства CAS13, нацеленных на РНК, является многообещающим новым дополнением технологий CRISPR / Cas в эффективном восстановлении транскриптов генов с привлекательным нецелевым профилем как на клеточном, так и на организменном уровнях. Недавно сообщалось, что система CRISPR/ CasRx может быть использована для достижения повсеместного и тканеспецифического снижения транскрипта гена у Drosophila melanogaster. В этой статье подробно описываются методы из недавней работы, состоящие из трех частей: 1) повсеместное in vivo эндогенное нацеливание на РНК с использованием двухкомпонентной системы CasRx; 2) повсеместное in vivo экзогенное нацеливание на РНК с использованием трехкомпонентной системы CasRx; и 3) тканеспецифическое нацеливание на РНК in vivo с использованием трехкомпонентной системы CasRx. Наблюдаемые эффекты таргетирования РНК включают целевые ген-специфические фенотипические изменения, снижение транскрипта целевой РНК и случайные фенотипы летальности, связанные с высокой экспрессией белка CasRx и коллатеральной активностью. В целом, эти результаты показали, что система CasRx способна нацеливаться на восстановление транскрипта РНК на уровне организма программируемым и эффективным образом, демонстрируя, что нацеливание на транскриптом in vivo и инженерия осуществимы и закладывают основу для будущих технологий таргетирования РНК на основе IN VIVO CRISPR.

Введение

С момента появления технологий Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) основное внимание в этой области было сосредоточено на редактировании ДНК, которое предлагает преобразующие приложения в медицине и ^{биотехнологии1}. Однако постоянное изменение последовательностей ДНК не всегда желательно из-за этических соображений. В свете этого недавние исследования начали разработку инструментов на основе CRISPR для нацеливания на РНК и продемонстрировали, что технологии CRISPR действительно могут быть использованы для нацеливания на РНК в различных биологических системах2,3,4,5,6,7. Во многих из этих протестированных систем в настоящее время широко используемым подходом к нацеливанию на РНК и восстановление транскрипта является РНК-интерференция (РНКи), которая далека от совершенства, часто демонстрируя различную эффективность и высокую нецелевую активность при использовании в vivo8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 . Поэтому, учитывая статус этих технологий, стоит дополнительно изучить потенциал инструментов на основе CRISPR для таргетинга на РНК.

В одном известном недавнем исследовании сообщалось, что рибонуклеаза CasRx, член класса Cas13d, может эффективно снижать уровни транскриптов генов в культуре клеток человека и обладает привлекательным нецелевым ^{профилем4}. Это открытие привело к вопросу о том, может ли эта новая рибонуклеаза поддерживать свою эффективность и низкую нецелевую скорость для РНК- таргетирования на уровне организма. Недавнее исследование решило этот вопрос, показав, что система CasRx может быть использована для достижения повсеместного и тканеспецифического снижения транскрипта гена у Drosophila melanogaster5.

Чтобы упростить удобство использования этого недавно опубликованного подхода, этот протокол детализирует методы из этой недавней работы, которая состоит из трех основных частей: 1) повсеместное нацеливание на РНК in vivo с использованием двухкомпонентной системы CasRx; 2) повсеместное in vivo экзогенное нацеливание на РНК с использованием трехкомпонентной системы CasRx; и 3) тканеспецифическое нацеливание на РНК vivo с использованием трехкомпонентной системы CasRx.

Были разработаны направляющие РНК (гРНК), нацеленные на различные гены-мишени под контролем вездесущего промотора, и были сгенерированы линии мух, экспрессирующие эти гРНК-содержащие конструкции. Также были спроектированы конструкции CasRx под управлением либо вездесущего промотора, либо промотора условной последовательности активации (UASt), активируемого фактором транскрипции GAL4, и были сгенерированы летающие линии, содержащие эти CasRx-содержащие конструкции. Каталитически неактивные конструкции CasRx, dCasRx, были разработаны и использованы в качестве отрицательных элементов управления. Повсеместное нацеливание РНК на мух достигается путем пересечения гРНК-экспрессирующих линий мух с вездесущими CasRx-экспрессирующими линиями мух. Потомство, экспрессирующее как конструкцию гРНК, нацеленную на конкретный транскрипт гена, так и белок CasRx, имеет повсеместное сокращение целевых транскриптов генов. Тканеспецифическое нацеливание РНК у мух достигается путем первого скрещивания гРНК-экспрессирующих мух с UASt-CasRx экспрессирующими мухами, получая трансгетерозиготных мух, несущих как гРНК, так и конструкции UASt-CasRx. Такие мухи, в свою очередь, скрещиваются с тканеспецифическими GAL4-экспрессирующими мухами, что приводит к генерации тканеспецифической экспрессии CasRx и РНК-таргетинга у мух.

Программируемый характер системы CasRx предлагает возможность настройки и оптимизации для достижения высокой эффективности и низкой внецелевой активности для таргетирования РНК in vivo. Потенциальные применения РНК-таргетинга на основе CRISPR многочисленны, включая замену РНКi в лаборатории и содействие борьбе с насекомыми-переносчиками в дикой природе. Из последних одной из глобальных неудовлетворенных потребностей является разработка эффективных средств борьбы с инфекциями РНК-вирусов, передаваемых через комаров. Многие РНК-вирусы, такие как вирус денге, Зика и чикунгунья, передаются через комаров, влияя на здоровье человека и способствуя смертности. Было внесено много предложений по созданию популяций комаров с устойчивостью к вирусам для профилактики заболеваний; однако ни одна современная технология не способна сделать комаров одновременно устойчивыми ко всем значимым РНК-вирусам18,19,20,21,22,23. Системы Cas, нацеленные на РНК, могут обеспечить отправную точку для такой технологии, обеспечив программируемую платформу для нацеливания на все РНК-вирусы, переносимые комарами.

протокол

1. Повсеместное нацеливание на РНК in vivo с использованием двухкомпонентной системы CasRx

1. Генерация вектора выражений Ubiq-CasRx и Ubiq-dCasRx
   1. Амплификация последовательности CasRx с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймером 1050E. C3 и 1050E. C4 и оригинальная конструкция CasRx pNLS-RfxCas13d-NLS-HA (pCasRx); и амплировать последовательность dCasRx с помощью ПЦР с праймером 1050E. C3 и 1050E. C4 и оригинальная конструкция dCasRx pNLS-dRfxCas13d-NLS-HA (pdCasRx)⁴ (таблица 1). После этого очистите усиленные фрагменты CasRx и dCasRx с помощью набора для очистки геля.
   2. Переварить базовый вектор (addgene plasmid #112686) с рестрикционными ферментами SwaI и ^PacI24. В полученных продуктах используют набор для гель-очистки более крупного фрагмента, который называется базовым векторным позвоночником.
   3. Собрать вектор Ubiq-CasRx с базовой векторной магистралью и фрагментом CasRx с помощью метода сборки Гибсона; собрать вектор Ubiq-dCasRx с базовой векторной магистралью и фрагментом dCasRx с помощью метода сборки ^{Гибсона25}.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Идентификатор addgene вектора Ubiq-CasRx (OA-1050E) равен #132416, а addgene ID вектора Ubiq-dCasRx (OA-1050R) — #132417.
2. Генерация вектора экспрессии гРНК
   1. Проектирование каждого фрагмента гРНК на основе следующих критериев: целевая последовательность длиной 30 нуклеотидов; максимальная длина поли-U растяжек в целевой последовательности составляет 4 пары оснований; содержание ГК целевой последовательности находится в пределах 30% - 70%; целевая последовательность, по прогнозам, не будет образовывать сильные структуры РНК шпильки; и целевая последовательность, содержащая минимальную предсказанную вторичную или третичную структуру ^РНК5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это исследование спроектировало каждую гРНК как 4 тандемные последовательности длиной 30 нуклеотидов, разнесенных 36 нуклеотидными длинными прямыми повторами и с 7-тиминовым терминатором на обоих ^{концах5}. Для экзогенного гена-мишени, GFP, те же критерии, что и выше, сопровождались добавлением фрагмента OpIE2-GFP5.
   2. Амплифицируйте последовательность промоторов U6:3 с помощью ПЦР с праймерами 1043.C1 и 1043.C23 и плазмидой Addgene #112688 (Таблица 1)²⁶. Гель-очистка усиленных фрагментов U6:3 с помощью набора для очистки геля.
   3. Переварить плазмиду addgene #112688 с ферментами рестрикции AscI и ^XbaI24. В полученных продуктах используют набор для гель-очистки более крупных фрагментов, который называется предосновной векторной магистралью.
   4. Соберите базовый вектор с предосновной векторной магистралью и фрагментом U6:3 с помощью метода сборки ^{Гибсона25}. Ниже базовый вектор называется OA-1043.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Идентификатор Addgene плазмиды OA-1043 # 164586.
   5. Синтезируйте фрагмент гРНК гена-мишени с помощью сервиса внешнего синтеза генов.
   6. Переваривайте базовый вектор OA-1043 с помощью фермента рестрикции PstI и ^NotI24. Сохраните весь продукт пищеварения, который называется переваренным ОА-1043.
   7. Собрать вектор экспрессии гРНК с переваренным OA-1043 и фрагментом гРНК-гена-мишени с помощью метода сборки ^{Гибсона25}.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Были изучены четыре гена-мишени: три были эндогенными (белый, Notch, желтый), один был экзогенным (GFP). Их идентификаторы Addgene: #132420 (^gRNAW), #132421 (^gRNAN), #132425 (^gRNAY) и #133304 (^gRNAGFP).
3. Генерация трансгенных мух
   1. Вводите векторы экспрессии в эмбрионы мух с помощью услуги внешней инъекции эмбрионов мух и эмбрионы от мух, содержащих сайты интеграции ØC31. Вырастите введенные эмбрионы при температуре 26 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Линия attp40w (с сайтами интеграции на ^2-й хромосоме) использовалась для генерации линий CasRx, а линия 8622 (с сайтами интеграции на ^3-й хромосоме) использовалась для генерации различных линий гРНК.
   2. Держите мух либо в виде гомозиготных линий, либо в виде сбалансированных гетерозиготных линий.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мухи Ubiq-CasRx и Ubiq-dCasRx были сохранены как гетерозиготные сбалансированные линии с CyO в качестве балансировщика. Кроме того, векторы Ubiq-CasRx и Ubiq-dCasRx содержат маркер dsRed. В результате мухи Ubiq-CasRx и Ubiq-dCasRx имеют следующие три фенотипа: dsRed-положительные, кудрявые крылья и белые глаза. ГРНК-экспрессирующие мухи держались в виде гомозиготных линий. Их фондовые номера Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC): #84118 (Ubiq-CasRx), #84119 (Ubiq-dCasRx), #84124 (^gRNAW), #84122 (^gRNAN), #84123 (^gRNAY), #84986 (^gRNAGFP).
4. Генетика мух (Рисунок 1А)
   1. Соберите 10 взрослых самок из гомозиготной линии гРНК и соберите 5 взрослых самцов из сбалансированной гетерозиготной линии Ubiq-CasRx/CyO. Поместите собранных самок и самцов мух, которых называют родительскими мухами, во флакон, дополненный сухим дрожжевым порошком (рисунок 1А).
   2. Повторите предыдущий шаг 3 раза, чтобы создать 3 реплики. Для контрольной группы используйте линию Ubiq-dCasRx/CyO, сохраняя при этом все остальное прежним.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для обычного стеклянного флакона с пищей достаточно 0,1 г сухого дрожжевого порошка. Используется рецепт корма для мух BDSC.
   3. Верните флаконы, содержащие родительских мух, при 26 °C в течение 48 часов. Затем удалите всех родительских мух из каждого флакона. Затем храните флаконы при температуре 26 °C не менее 20 дней.
   4. Наблюдайте за флаконами каждый день, чтобы увидеть, появились ли какие-либо новые взрослые потомки из кукол поколения F1. Если это так, обезболите их углекислым газом, вставив трубку, подключенную к резервуару для углекислого газа, внутрь флаконов мухи, а затем включите переключатель потока на 10 секунд.
   5. Как только мухи станут неподвижными, опорожните их из флакона на нахлыстовую площадку, которая также соединена с резервуаром с углекислым газом, и углекислый газ непрерывно вытекает через налетную площадку.
   6. Оцените фенотип обезболенных мух и визуализируйте их с помощью цветной камеры, подключенной к флуоресцентному стереомикроскопу. Подсчитайте количество потомств с разными фенотипами. Используйте программное обеспечение для обработки изображений для постобработки и компиляции изображений (рисунок 2A - 2D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Основываясь на менделевской генетике, среди потомков для каждого скрещивания ожидаются два типа мух (рисунок 1A).
5. РНК-Сек (Рисунок 2E – 2G)
   1. Сбор образцов
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите подходящий метод сбора образцов из 3 приведенных ниже примеров; Требуется 3 реплики для каждого отдельного типа образца.
      1. Сбор образцов головы взрослой мухи
         1. Соберите 10 девственных взрослых самок мух из гомозиготной линии гРНК. Соберите 5 взрослых самцов мух из сбалансированной гетерозиготной линии Ubiq-CasRx/CyO. Поместите собранных самок и самцов мух, которые являются родительскими мухами, во флакон, дополненный сухим дрожжевым порошком.
         2. Повторите предыдущий шаг 3 раза для 3 реплик. Для контрольной группы используйте линию Ubiq-dCasRx/CyO, сохраняя при этом все остальное прежним.
         3. Верните флаконы, содержащие родительских мух, при 26 °C в течение 48 часов. Затем удалите всех родительских мух из каждого флакона. Затем держите флаконы при температуре 26 °C до тех пор, пока из куколок не выйдут потомства.
         4. Соберите 10 1-дневных взрослых мух с правильным фенотипом. Обезболить мух углекислым газом, затем отрезать голову мухи и поместить головки в центрифужную трубку объемом 1,5 мл на сухом льду. Храните трубку центрифуги при температуре -80 °C. Повторите этот шаг 3 раза для 3 реплик.
      2. 17 – 20-часовой отбор образцов эмбрионов
         1. Соберите 8-10 девственных взрослых самок мух из гомозиготной линии гРНК. Соберите 4-5 взрослых самцов мух из сбалансированной гетерозиготной линии Ubiq-CasRx/CyO. Поместите собранных самок и самцов мух, которые являются родительскими мухами, во флакон, дополненный сухим дрожжевым порошком.
         2. Повторите предыдущий шаг 3 раза для 3 реплик. Для контрольной группы используйте линию Ubiq-dCasRx/CyO, сохраняя при этом все остальное прежним.
         3. Верните флаконы, содержащие родительских мух, при 26 °C в течение 48 часов.
         4. Подготовьте одну камеру сбора эмбрионов виноградного сока для каждой реплики по этому рецепту: 376 мл воды, 126 мл виноградного сока, 15 г агара и 6 г сахарозы. Поместите носитель в стакан объемом 1 л и поставьте его в микроволновую печь в течение 5-6 минут, внимательно следя за средой в стакане, чтобы проверить, появляются ли пузырьки / пена. Если это так, остановите микроволновую печь и дайте пузырьку / пене осесть. Продолжайте микроволновку таким образом, пока пузырь не станет прозрачным. Не закручивайтесь, пока все пузырьки не очистятся. Наконец, добавьте 10 мл 100% спирта и 5 мл уксусной кислоты. Хорошо перемешайте, затем выпейте среду в 35 мм чашки Петри серологическим пипетом объемом 25 мл. Когда среда затвердевает в чашке Петри, она готова к использованию.
         5. В конце 48-часовой инкубации переносят родительских мух в камеры сбора эмбрионов виноградного сока и инкубируют их при 26 °C в течение 3 ч. Затем удалите взрослых мух, удерживая свежеуложенные эмбрионы на пластинах виноградного сока еще 17 ч при 26 °C.
         6. После инкубации соберите 50-100 эмбрионов из пластин виноградного сока, очистите поверхность эмбриона, погрузив их в деионизированную воду, затем перенесите их в центрифужную трубку объемом 1,5 мл на льду. Хранить их при -80 °C. Повторите этот шаг 3 раза для 3 реплик.
      3. Первый отбор проб личинок instar
         1. Соберите 8-10 девственных взрослых самок мух из гомозиготной линии гРНК. Соберите 4-5 взрослых самцов мух из сбалансированной гетерозиготной линии Ubiq-CasRx/CyO. Поместите собранных самок и самцов мух, которые являются родительскими мухами, во флакон, дополненный сухим дрожжевым порошком. Повторите этот шаг 3 раза для 3 реплик. Для контрольной группы используйте линию Ubiq-dCasRx/CyO, сохраняя при этом все остальное прежним.
         2. Верните флаконы, содержащие родительских мух, при 26 °C в течение 48 часов. Затем переведите взрослых мух в другой новый обычный флакон с пищей для ночной инкубации (16 ч) при 26 °C. Затем удалите взрослых мух.
         3. Держите флакон, содержащий эмбрион, при 26 °C в течение 24 часов, затем забивайте трансгетерозиготные первые личинки под микроскопом, используя различные маркеры. Соберите 15-30 личинок с правильными фенотипами и поместите их в центрифужную трубку объемом 1,5 мл и храните при -80 °C. Повторите этот шаг 3 раза для 3 реплик.
   2. Секвенирование
      1. Экстракция РНК: используйте коммерчески доступный набор для экстракции РНК и следуйте инструкциям набора для обработки всех образцов. Затем инкубируйте извлеченные образцы РНК с коммерчески доступной дезоксирибонуклеазой и следуйте ее инструкциям, чтобы удалить любую загрязняющую ДНК из образцов.
      2. Измерьте концентрацию РНК с помощью коммерчески доступного спектрофотометра UV-vis. Измерьте целостность РНК в образцах, используя коммерчески доступную установку для анализа целостности РНК.
      3. Создайте библиотеки RNA-seq, используя коммерчески доступный комплект подготовки библиотеки РНК.
      4. Используйте внешний сервис секвенирования для виртуализации библиотек со следующими настройками: режим однократного чтения; длина чтения: 50nt, глубина: 20 миллионов чтений на библиотеку. Выполните базовые вызовы с помощью RTA 1.18.64, а затем преобразуйте данные в FASTQ с помощью bcl2fastq 1.8.4.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Необработанные данные секвенирования можно найти в Архиве чтения Национального центра секвенирования информации о биотехнологии (идентификатор представления: SUB6818910 [BioProject: PRJNA600654]).
   3. Биоинформатика
      1. Карта считывает данные секвенирования до генома Drosophila melanogaster Release 6 из проекта Berkeley Drosophila Genome Project (номер присоединения GenBank: GCA_000001215.4) и экзогенных последовательностей CasRx и GFP с использованием настройки параметров по умолчанию STAR ^aligner28 с добавлением опции фильтра «-outFilterType BySJout» и Drosophila_melanogaster «-sjdbGTFfile». BDGP6.22.97.gtf" файл формата переноса генов из ENSEMBL.
      2. Определите количество необработанных транскриптов для каждой аннотированной расшифровки с помощью функции Counts35, используя параметры «-t exon -g gene_id -M -O --fraction». Затем нормализуйте количество необработанных транскриптов, используя общее количество транскриптов с помощью perl-скрипта «addTpmFpkmToFeatureCounts.pl».
      3. Используйте метод максимальной апостериории с исходной оценкой усадки в конвейере DESeq2 для оценки изменения логарифмической складки транскриптов каждого гена (LFC).

2. Повсеместное in vivo экзогенное нацеливание на РНК с использованием трехкомпонентной системы CasRx

1. Генерация экзогенного целевого вездесущего вектора экспрессии
   1. ПЦР амплифицируют фрагмент промотора Ubiq с помощью праймеров 1052B. C1 и 1052B. C2 и плазмида Addgene #112686 ²⁶. Затем ПЦР амплируют фрагмент T2A-eGFP, амплифицированный из плазмиды Addgene #112686 праймерами 908A.1 и 908A.2 (таблица 1)²⁶. Затем ПЦР амплируют фрагмент промотора Ubiq в виде обратной последовательности с использованием плазмиды Addgene #112686 праймерами 908A.3 и 908A.4 (Таблица 1)²⁶. Гель-очищают промоторный фрагмент Ubiq, фрагмент T2A-eGFP и обратный фрагмент промотора Ubiq с помощью набора для очистки геля.
   2. Закажите пользовательскую последовательность кодирования люциферазы светлячка и пользовательский фрагмент, содержащий фрагмент p10 3'UTR, обратный ренилла люцифераза, за которым следует фрагмент SV40 3'UTR.
   3. Переварить плазмиду addgene #112688 с ферментами рестрикции AscI и ^XbaI24. В полученных продуктах гель-очистка более крупных фрагментов с помощью набора для очистки геля, который называется базовым векторным позвоночником.
   4. Используйте метод сборки Гибсона для сборки базового вектора с базовой векторной магистралью и следующими фрагментами: фрагмент промотора Ubiq, фрагмент T2A-eGFP, обратный фрагмент промотора Ubiq, кодирующая последовательность люциферазы светлячка и обратная люцифераза ренилла, за которой следует фрагмент SV40 ^3'UTR25.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Идентификатор Addgene результирующего вектора экспрессии дуальной люциферазы (OA-1052B) равен #132426.
2. Генерация вектора экспрессии гРНК
   1. ПЦР амплифицируют промоторную последовательность U6:3 с использованием праймеров 1043.C1 и 1043.C23 и плазмиды Addgene #112688 (Таблица 1)²⁶. Гель-очистка усиленных фрагментов U6:3 с помощью набора для очистки геля.
   2. Переварить плазмиду адджена #112688 с ферментами рестрикции AscI и ^XbaI24. В полученных продуктах гель-очистка более крупных фрагментов, которая называется предосновной векторной магистралью, используя набор для очистки геля.
   3. Соберите базовый вектор с предбазовой векторной магистралью и фрагментом U6:3 с помощью метода сборки ^{Гибсона25}. Ниже базовый вектор называется OA-1043.
   4. Синтезируйте фрагмент гРНК гена-мишени с помощью сервиса внешнего синтеза генов.
   5. Переваривайте базовый вектор OA-1043 с помощью фермента рестрикции PstI и ^NotI24. Сохраните весь продукт пищеварения, который называется переваренным ОА-1043.
   6. Собрать вектор экспрессии гРНК с переваренным OA-1043 и фрагментом гРНК-гена-мишени с помощью метода сборки ^{Гибсона25}.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Идентификатор addgene результирующей плазмиды (OA-1052K) равен #132422.
3. Генерация трансгенных мух
   1. Ввести вектор OA-1052B в эмбрионы мух с использованием эмбрионов мух, содержащих сайт интеграции ØC31 на 3-й хромосоме, номер 9744 мухи BDSC, через услугу внешней инъекции эмбриона мухи. Аналогичным образом, вводите вектор OA-1052K в эмбрионы мух, используя эмбрионы мух, содержащие сайт интеграции ØC31 на 3-й хромосоме, номер 8622 мухи BDSC. Вырастите введенные эмбрионы при температуре 26 °C.
   2. Держите мух, экспрессирующих двойную люциферазу, и гРНК мухи в виде гомозиготных линий; поддерживать линии Ubiq-CasRx как двойные сбалансированные гетерозиготные линии, пересекая однобалансированную гетерозиготную линию Ubiq-CasRx, генерируемую в секции 1, к балансирующим линиям, несущим хромосому балансира TM6 с маркером стерни (Stb), и сохранять только двойные сбалансированные потомки с белоглазыми, кудрявыми крыльями и dsRed-флуоресцентными фенотипами одновременно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Номера запасов мух BDSC: #84127 (Ubiq-Fluc-Rluc), #84125 (^gRNAFluc).
4. Генетика мух (рисунок 1B и рисунок 3A)
   1. Соберите 8-10 девственных взрослых самок мух из линии, экспрессирующей двойную люциферазу. Соберите 4-5 взрослых самцов мух из сбалансированного гетерозиготного Ubiq-CasRx/CyO; +/TM6, линия Stb, которая показывает белоглазые, кудрявые крылья и dsRed флуоресценцию одновременно. Поместите собранных самок и самцов мух, которые являются родительскими мухами, во флакон, дополненный сухим дрожжевым порошком (далее называемый Крестом Шага 1).
   2. Повторите предыдущий шаг 3 раза для 3 реплик. Для контрольной группы используйте Ubiq-dCasRx/CyO; +/TM6, линия Stb, сохраняя при этом все остальное прежним.
   3. Верните флаконы Step 1 Cross, содержащие родительские мухи при температуре 26 °C в течение 48 часов. Затем удалите всех родительских мух из каждого флакона. Затем держите флаконы при температуре 26 °C не менее 14 дней. За это время соберите 8-10 женских девственниц из гомозиготной линии гРНК, нацеленной на люциферазу светлячка. Повторите этот шаг 3 раза для 3 реплик.
   4. Соблюдайте флаконы Step 1 Cross каждый день, чтобы увидеть, появляется ли из куколок новая взрослая муха. Если это так, обезболите их углекислым газом, соберите 5 самцов мух, экспрессирующих как Ubiq-CasRx (или Ubiq-dCasRx), так и репортер двойной люциферазы из потомков и поместите их в новый флакон вместе с 10 девственными самками из линии гРНК, нацеленной на люциферазу светлячка (далее именуемой Step 2 Cross). Повторите этот шаг 3 раза для 3 реплик.
   5. Соберите еще 5 однодневных самцов, экспрессирующих как Ubiq-CasRx (или Ubiq-dCasRx), так и двойной люциферазный репортер из флаконов Step 1 Cross и высиживайте их в течение 2-4 дней при 26 °C. Затем переложите их в центрифужную трубку объемом 1,5 мл и храните при -80 °C. Повторите этот шаг 3 раза для трех реплик.
   6. Верните флаконы Step 2 Cross, содержащие родительские мухи при температуре 26 °C, в течение 48 часов. Затем удалите всех родительских мух из каждого флакона. Затем храните флаконы при температуре 26 °C не менее 20 дней.
   7. Соблюдайте флаконы Step 2 Cross каждый день, чтобы увидеть, появились ли какие-либо новые взрослые потомки из куколок. Если это так, обезболивайте их углекислым газом, оцените фенотипы обезболенных мух и визуализируйте их с помощью цветной камеры, оснащенной флуоресцентным стереомикроскопом. Подсчитайте количество потомств с разными фенотипами. Используйте программное обеспечение для обработки изображений для постобработки и компиляции изображений (рисунок 3B – 3C).
      Примечание: Менделевская генетика предполагает, что, если все мухи жизнеспособны, среди потомков из Step 2 Cross ожидается 4 типа мух, каждый из которых составляет 25% популяции (рисунок 1B и рисунок 3A).
5. Анализ люциферазы (Рисунок 3D)
   1. Генерируйте тройные трансгетерозиготные мухи, а также контрольные мухи, повторяя шаги 2.4.1-2.4.5. Собирайте самцов мух при рождении и старите их до 3-дневного возраста.
   2. Переведите 3-дневных мух в центрифужные трубки объемом 1,5 мл и лизируйте их с помощью пестика и буфера лизиса люциферазы коммерчески доступного набора для анализа люциферазы.
   3. Используйте 5 мкл лизированной ткани из каждого образца для измерения активности светлячка и ренилла люциферазы с использованием коммерчески доступного набора для анализа люциферазы и люминометра.

3. Тканеспецифическое нацеливание на РНК in vivo с использованием трехкомпонентной системы CasRx

1. Генерация вектора выражений UASt-CasRx и UASt-dCasRx
   1. ПЦР амплируют последовательность промоторов UASt с использованием плазмиды pJFRC81 и праймеров 1041.C9 и 1041.C11; затем ПЦР амплируют фрагмент CasRx с использованием плазмиды OA-1050E (Addgene ID #132416) и праймеров 1050L. C1 и 1050E. С4; а затем ПЦР амплируют фрагменты dCasRx с помощью плазмиды OA-1050R (Addgene ID #132417) и праймеров 1050L. C1 и 1050E. С4 (Таблица 1)²⁶. Гелевая очистка усиленной последовательности промоторов UASt, фрагментов CasRx и dCasRx с помощью набора для очистки геля.
   2. Переваривает базовый вектор (addgene plasmid #112686) с рестрикционными ферментами NotI и ^PacI24. В полученных продуктах гель-очистка более крупного фрагмента, который называется базовым вектором позвоночника, используя набор для очистки геля.
   3. Собрать вектор UASt-CasRx с базовой векторной магистралью, последовательностью промотора UASt и фрагментом CasRx с помощью сборки Gibson; затем соберите вектор UASt-dCasRx с базовой векторной магистралью, последовательностью промотора UASt и фрагментом dCasRx с помощью метода сборки ^Gibson25.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вектор UASt-CasRx — это плазмида Addgene #132418, а вектор UASt-dCasRx — плазмида Addgene #132419
2. Генерация трансгенных мух
   1. Вводить вектор UASt-CasRx в эмбрионы мух с помощью услуги инъекции эмбрионов мух и эмбрионов от 8621 интеграционного сайта ØC31 мух на их ^2-х хромосомах; затем вводят вектор UASt-dCasRx в эмбрионы мух с помощью услуги инъекции эмбрионов мух и эмбрионы от сайта интеграции ØC31 мух ØC31 на их ^2-х хромосомах. Вырастите введенные эмбрионы при температуре 26 °C.
   2. Держите мух в виде двойных сбалансированных гетерозиготных линий с маркерами CyO и Sb. ПРИМЕЧАНИЕ: Идентификаторы летающих линий в BDSC: 84121 (UASt-CasRx) и 84120 (UASt-dCasRx).
3. Генетика мух (Рисунок 1C)
   1. Закажите нужные линии GAL4 у BDSC; Получение соответствующих линий гРНК из шага 3.2.2 (или из BDSC).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Были использованы следующие 2 мухи GAL4 от BDSC: GAL4-GMR (идентификатор BDSC: #29967), GAL4-y (идентификатор BDSC: #44373). Использовались те же 3 линии гРНК, сгенерированные в первом разделе: ^gRNAw (BDSC ID: #84124), ^gRNAN (BDSC ID #84122), ^gRNAY (BDSC ID: #84123).
   2. Соберите 5-10 девственных взрослых самок мух из линии гРНК. Соберите 2-4 взрослых самца мух из двойного сбалансированного гетерозиготного UASt-CasRx/CyO; +/TM6, линия Sb, которая показывает белоглазые, кудрявые крылья и dsRed флуоресценцию одновременно. Поместите собранных самок и самцов мух, которые являются родительскими мухами, в обычный пищевой флакон (далее называемый Крестом Шага 1). Повторите этот шаг 3 раза для 3 реплик. Для контрольной группы используйте UASt-dCasRx/CyO; +/TM6, линия Sb, сохраняя при этом все остальное прежним.
   3. Верните флаконы Step 1 Cross, содержащие родительские мухи при температуре 26 °C в течение 48 часов. Затем удалите всех родительских мух из каждого флакона. Затем держите флаконы при температуре 26 °C не менее 14 дней. За это время соберите 5-10 девственниц из линейки GAL4. Повторите этот шаг 3 раза для 3 реплик.
   4. Соблюдайте флаконы Step 1 Cross каждый день, чтобы увидеть, появляется ли из куколок новая взрослая муха. Если это так, обезболите их углекислым газом, соберите 2-4 самца мух, экспрессирующих как UASt-CasRx (или UASt-dCasRx), так и вектор гРНК от потомков, которые одновременно имеют dsRed-флуоресцентный и щетинковый фенотипы. Поместите собранных самцов из Креста Шага 1 в новый флакон вместе с 5-10 собранными девственными самками из линии GAL4 (далее именуемой Крестом Шага 2). Повторите этот шаг 3 раза для 3 реплик.
   5. Верните флаконы Step 2 Cross, содержащие родительские мухи при температуре 26 °C, в течение 48 часов. Затем удалите всех родительских мух из каждого флакона. Затем храните флаконы при температуре 26 °C не менее 20 дней.
   6. Соблюдайте флаконы Step 2 Cross каждый день, чтобы увидеть, появляется ли какая-либо новая взрослая муха из куколок. Если это так, обезболивайте их углекислым газом, оцените фенотипы обезболенных мух и визуализируйте их с помощью цветной камеры, оснащенной флуоресцентным стереомикроскопом. Подсчитайте количество потомств с разными фенотипами. Используйте программное обеспечение для обработки изображений для постобработки и компиляции изображений (рисунок 4).
      Менделевская генетика предполагает, что, если все мухи жизнеспособны, среди потомков из Step 2 Cross ожидается 4 типа мух, каждый из которых составляет 25% популяции (рисунок 1C).

Результаты

Повсеместное нацеливание на РНК in vivo с использованием двухкомпонентной системы CasRx
Трансгетерозиготные мухи _F1, экспрессирующие как Ubiq-CasRx, так и гРНК (нацеленные как на эндогенные, так и на экзогенные гены), показали выраженные фенотипы по сравнению с контрольными мухами, экспрессирующими конструкции Ubiq-dCasRx и гРНК (рисунок 2 и рисунок 4). В частности, трансгетерозиготные мухи CasRx имеют значительно более низкие уровни выживаемости по сравнению с трансгетерозгическими мухами dCasRx, что указывает на токсичность системы Ubiq-CasRx (рисунок 2A и рисунок 4A). Стоит отметить, что как трансгетерозиготные мухи CasRx, так и dCasRx имеют менее 50% наследования, что является ожидаемым соотношением, основанным на менделевской генетике. Из трех генов-мишеней Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAN/+ летает и Ubiq-CasRx/+; ^Мухи U6-gRNAY/+ нежизнеспособны (0% наследования) и не выросли за пределы второй стадии личинок (рисунок 2A-2B). Уцелевший Ubiq-CasRx/+; Мухи U6-gRNAw/+, наследование которых составило 12,9%, показали отчетливый полностью проникающий белоглазый фенотип (рисунок 2B). В дополнение к наблюдаемым признакам, связанным с CasRx, мы смогли подтвердить значительное снижение транскриптов генов-мишеней для 3 генов-мишеней: Notch, yellow и GFP (рисунок 2E-2G). Снижение транскриптов белых генов наблюдалось у мух Ubiq-CasRx/+, U6-gRNAw/+ по сравнению с контрольными мухами Ubiq-dCasRx/+, U6-gRNAW/+, хотя снижение не было статистически значимым (рисунок 2E - 2F). Доказательства нецелевой активности, индуцированной CasRx, были обнаружены при сравнении дифференциально экспрессированных транскриптов между образцами из CasRx-экспрессирующих мух и образцами из dCasRx-экспрессирующих мух (рисунок 2E, 2G). Количество нецелевых транскриптов, значительно дифференцированно выраженных, выглядит следующим образом: белый — 253 (1,4% от общего числа транскриптов); Вырез, 300 (1,7%); желтый, 41 (0,23%); GFP, 5 880 (33%) (Рисунок 2G). Из 17 779 различных транскриптов 6 нецелевых транскриптов были значительно дифференцированно выражены во всех 4 группах образцов. Одним из 6 идентифицированных транскриптов был Gadd45, ген, участвующий в апоптозе и клеточной остановке у мух, что повышает вероятность того, что ферментативное действие CasRx может либо непосредственно вызвать клеточный апоптоз, либо косвенно вызвать неправильную экспрессию других генов, что, в свою очередь, приводит к апоптозу. Наконец, стоит отметить, что мухи Ubiq-CasRx и Ubiq-dCasRx не были установлены как гомозиготные запасы, по-видимому, из-за токсичности, придаваемой высокой повсеместной экспрессией. В результате гетерозиготные мухи Ubiq-CasRx/CyO и Ubiq-dCasRx/CyO использовались для скрещивания с гомозиготными линиями гРНК. В целом, двухкомпонентная система Ubiq-CasRx способна достичь повсеместного нацеливания РНК как на эндогенные, так и на экзогенные мишени, что приводит к наблюдаемым фенотипам и снижению транскриптов. Эти результаты также показали, что CasRx-опосредованное нацеливание РНК может привести к токсичности in vivo.

Повсеместное in vivo экзогенное нацеливание на РНК с использованием трехкомпонентной системы CasRx
Результаты двухступенчатого скрещивания показали, что, несмотря на экзогенную природу гена-мишени (т.е. Fluc), экспрессия всех трех трансгенов в тройных трансгетероготах _F2 (Ubiq-CasRx/+; ^gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) приводила к 100% летальности по сравнению с контрольными кроссами с участием Ubiq-dCasRx, где летальность не наблюдалась у тройных трансгетерозигот _F2 (Ubiq-dCasRx/+; ^gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) (Рисунок 3B-C ). Более конкретно, только комбинация всех трех трансгенов (Ubiq-CasRx/+; ^gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) привела к 100% летальности (рисунок 3B и D), в то время как (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/TM6) и (Ubiq-CasRx/+; Генотипы Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6) были жизнеспособными и не имели фенотипов со скоростью наследования, соответствующей ожидаемым менделевским скоростям передачи, предполагая, что наличие целевой последовательности (т.е. светлячка люциферазы) в сочетании с Ubiq-CasRx/+ и ^gRNAFluc - это то, что привело к наблюдаемым фенотипам летальности, предположительно вытекающим из коллатеральной активности ферментов ^Cas132,8 . Кроме того, отсутствуют различимые фенотипы или резкое влияние на наследование у трансгетерозигот _F1 (Ubiq-CasRx/+; ^gRNAFluc/+ или Ubiq-CasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc /+) наблюдались по сравнению с контролем Ubiq-dCasRx (Ubiq-dCasRx/+; ^gRNAFluc/+ или Ubiq-dCasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc /+) (Рисунок 3B), что указывает на то, что каталитически активный фермент необходим для получения наблюдаемых фенотипов летальности. Кроме того, уровни экспрессии Fluc и Rluc у мух всех жизнеспособных генотипов не показали значительного снижения экспрессии Fluc в тройных трансгетерозиготах Ubiq-dCasRx (Ubiq-dCasRx/+; ^gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) по сравнению с контролем с двойным репортером люциферазы. Это говорит о том, что уровни экспрессии белка Fluc не были снижены при нацеливании dCasRx (рисунок 3D). Взятый вместе, общий фенотип летальности в двух различных экспериментах с casRx-опосредованной вездесущей РНК-мишенью показывает, что при повсеместном использовании на тканях Опосредованное CasRx РНК-нацеливание может быть токсичным для организма.

Тканеспецифическое нацеливание на РНК in vivo с использованием трехкомпонентной системы CasRx
Высокий уровень токсичности, наблюдаемый в вездесущих экспериментах по нацеливанию на РНК, побудил нас исследовать тканеспецифическое нацеливание на РНК с использованием трехкомпонентной системы CasRx, подробно описанной в разделе методов. Действительно, наблюдаемый уровень токсичности был снижен, когда общая экспрессия CasRx была снижена с использованием промотора UASt по сравнению с промотором Ubiq, это иллюстрируется тремя аспектами: 1) линии UASt-CasRx и UASt-dCasRx поддерживались в качестве гомозиготных линий, хотя на основе двухступенчатой кросс-схемы для выполнения скрещиваний использовались двойные сбалансированные линии UASt-CasRx и UASt-dCasRx, 2) все показатели тройного трансгетерозиготного наследования DCasRx поколения _F2 соответствовали ожидаемому 25% менделевскому уровню наследования, и 3) фенотип тройной трансгетерозиговой летальности CasRx поколения _F2 был умеренно снижен. В эксперименте по белому таргетированию из 25% менделевских показателей наследования, ожидаемых у тройных трансгетерозигот _F2, наблюдалось только 0,57% жизнеспособных взрослых мух (UASt-CasRx/+; ^gRNAw/GMR-Gal4), все из которых демонстрировали тяжелую специфическую пигментацию и морфологические фенотипы глаз (рисунки 4A и 4B). Для кросса белого таргетинга частота наследования Тройного трансгетерозигоза _F2, экспрессирующего CasRx, была значительно ниже, чем у dCasRx-экспрессирующей тройной трансгетерозиговой контрольной группы (27,6%) (рисунок 4A). В эксперименте с таргетированием Notch CasRx-экспрессирующие тройные трансгетерозиговые, несущие все три трансгена, были на 100% смертельными, в то время как контрольный уровень наследования dCasRx составлял 29,3% (рисунок 4A). В эксперименте с желтым таргетированием _F2 тройной трансгетерозиговой CasRx-экспрессирующей, ^gRNAY и y-GAL4 показали маргинальное снижение пигмента хитина в виде небольших пятен желтой кутикулы на грудной клетке и брюшной полости со скоростью наследования 2,67%, что намного ниже, чем у контрольной группы dCasRx (25,2%) (Рисунок 4A ). Все контрольные тройные трансгетерозиготные мухи dCasRx не представляли очевидных фенотипов, как CasRx-экспрессирующие мухи, что указывает на то, что каталитическая активность CasRx способствовала наблюдаемым фенотипам. Низкая скорость наследования в тройной трансгетерозиговой группе CasRx предполагает, что в нацеливании на РНК CasRx существуют два источника токсичности: один связан с высокой экспрессией CasRx, токсичность которого была снижена ограничительной экспрессией CasRx, другой связан с коллатеральной активностью. Взятые вместе, эти результаты показали, что система CasRx может достичь тканеспецифического нацеливания на РНК in vivo за счет использования классической системы Gal4 / UASt и в то же время снизить токсичность. Однако токсичность и случайные фенотипы летальности по-прежнему наблюдались на более низком уровне тяжести по сравнению с вездесущими подходами, что указывает на то, что активность коллатерального расщепления связана с токсичностью.

Рисунок 1: Общий обзор нацеливания на РНК с использованием системы Cas13D. (A) Схемы одноступенчатого генетического кросса в вездесущей РНК-таргетинге in vivo с использованием двухкомпонентной системы CasRx. (B) Схемы двухступенчатого генетического скрещивания в вездесущей in vivo экзогенной РНК-таргетинге с использованием трехкомпонентной системы CasRx. (C) Схемы двухступенчатого генетического скрещивания в тканеспецифической РНК in vivo с использованием трехкомпонентной системы CasRx. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Повсеместное нацеливание на РНК in vivo с использованием двухкомпонентной системы CasRx (перепечатано5). (A) Общий процент наследования трансгетерозиготных мух, наследующих Ubiq-CasRx (или Ubiq-dCasRx) и гРНК. Синее затенение на прямоугольном графике указывает на пенетрантность фенотипа. (B) Фенотипы трансгетерозиготных мух. Стрелки указывают на некроз тканей в глазу. Черно-белая муха, помеченная буквой «X», символизирует летальность. (C) Общий процент наследования трансгетерозиготных мух двунаправленных скрещиваний между мухами Ubiq-CasRx (или Ubiq-dCasRx) и gRNAGFP-OpIE2-GFP. M, материнское наследование CasRx; P, отцовское наследование CasRx. (D) Личинки F1 потомства в отцовском кресте. (E) Максимальные апостериорные оценки транскриптов для изменения логарифмической складки. Использовался конвейер DESeq2. (F) Расшифровок на миллион (TPM), предназначенных для CasRx или dCasRx. (G) CasRx-диспендент дифференциально выраженный процент стенограмм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Повсеместное in vivo экзогенное нацеливание РНК с использованием трехкомпонентной системы CasRx. (A) Схемы двухступенчатого генетического кросса. (B) Общий процент наследования для всех генотипов, возникающих в поколении _F2 . Наследование всех трех трансгенов (Ubiq-CasRx, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc и ^gRNAFLuc) в потомстве _F2 привело к 100% летальности и было значительно ниже по сравнению с контрольной группой тройных трансгетерозигот Ubiq-dCasRx (p = 0,001, t-тест). (C) Перенос только Ubiq-CasRx/^gRNAFluc или Ubiq-CasRx и Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc сам по себе не приводил к тяжелой летальности, а соотношения наследования между трансгетерозиготами Ubiq-CasRx и Ubiq-dCasRx существенно не отличались (p = 0,41 и p = 0,51, соответственно, t-тест). (D) Соотношение люциферазы, нормализующее показания Fluc к показаниям Rluc. Тройные трансгетерозиготные мухи, экспрессирующие Ubiq-CasRx, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc, ^gRNAFLuc , были эмбрионально летальными, которые были представлены мухой с «X», и в результате экспрессия люциферазы не измерялась. Соотношение Fluc/Rluc трансгетерозигот Ubiq-CasRx/+, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6, Stb было значительно ниже, чем у других Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc-экспрессирующих групп (p = 1,2e-06 или ниже, t-тест). Результаты из группы, состоящей только из ^gRNAFLuc, были значительно ниже, чем у всех других групп (p = 1,2e-06 или ниже, t-тест). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Тканеспецифическое нацеливание на РНК in vivo с использованием трехкомпонентной системы CasRx (перепечатано5). (A) Общий процент наследования тройных трансгетерозиготных мух, несущих три трансгена (UASt-CasRx или UASt-dCasRx, gRNAs и Gal4-driver. (B) Фенотипы тройных трансгетерозиготных мух. Белая стрелка указывает на уменьшение пигмента хитина в грудной клетке. Черно-белая муха, помеченная буквой «X», символизирует летальность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Строить	Описание	Букварь	Последовательность праймеров (от 5' до 3')	Шаблон ПЦР
ОА-1050Е	КасРх	1050Е. С3	ТАКТААТТТЦКАК АКТКТАТТТТГАК CCGCAGATTAATTA АТГАГККККААГА АГААА	pNLS-RfxCas13d-NLS-HA (pCasRx)
		1050Е. С4	КААТТГАТТТТТА ТТТТАААААКГАТТ CATTCTAGCTAGCT TAAGCGTAATCTGG ААКА
ОА-1050Р	дКасРх	1050Е. С3	ТАКТААТТТЦКАК АКТКТАТТТТГАК CCGCAGATTAATTA АТГАГККККААГА АГААА	pNLS-dRfxCas13d-NLS-HA (pdCasRx)
		1050Е. С4	КААТТГАТТТТТА ТТТТАААААКГАТТ CATTCTAGCTAGCT TAAGCGTAATCTG ГААКА
ОА-1050Л	Промоутер UASt	1041,с9	GCGGGTTCTCGA CGGTCACGGCGG GCATGTCGACGC GGCCGCAACCAA КААКТАГТАГ	pJFRC81
		1041.С11	CTGGCCTCCACC ТТТКТКТТЦТТКТТТТТКТ TGGGGCTCATGT ТТАААККААТТ CCCTATTCAGA
	КасРх	1050л. С1	ААТАКААГАГАГА ГААККТГААТА ГГГААТТГГТТ TTAAACATGAGC ККАААГАГАА	pCasRx
		1050Е. С4	КААТТГАТТТГТ ТАТТТТААААК ГАТТКАТТКТА GCTAGCTTAAG CGTAATCTGGA АСА
ОА-1050С	Промоутер UASt	1041,с9	GCGGGTTCTC GACGGTCACG GCGGGCATGT CGACGCGGCC ГКААККААКАА КАКТАГТАГ	pJFRC81
		1041.С11	CTGGCCTCCA ККТТТКТТКТК ТТКТТГГГГКТ КАТГТТТАААК CCAATTCCCTA ТЦАГА
	дКасРх	1050л. С1	ААТАКААГААГ АГААККТГААТ АГГГААТТГГ ТТТАААКАТГАГ КЦККААГААГАА	pdCasRx
		1050Е. С4	КААТТГАТТТГТ ТАТТТТААААК ГАТТКАТТКТАГ CTAGCTTAAGCG ТААТКТГГААКА
ОА-1043	Промоутер U6:3	1043,С1	ГГГААТТГГА АТТГГКААТАТ TTAAATGGCGGC GCGCCGAATTCT TTTTTGCTCACCT	Адгенная плазмида #164586
		1043,с23	ACACTAGTGGAT CTCTAGAGGTAC CGTTGCGGCCG КААААААГТТГТ ААТАГЦККТКА AAACTGGACCTT CCACAACTGCAG CCGACGTTAAAT ТГААА
ОА-1052Б	Промоутер Ubiq	1052Б. С1	ГГГААТТГГКА ATATTTAAATGGC GGCTGCAGC GCAGATCGCCGAT	Адгенная плазмида #112686
		1052Б. С2	ТТТЦТТТТАГТТТТТТТТ ТТГГГГТКТККЦ ATCCTAGGTCTG CGGGTCAAAATA ГАГАТГ
	Т2А-эГФП	908А1	АТАААГГЦКААГ ААГГГГГГАААА ГАЦГКЦГТГГ АГГГКАГАГГА СЛКПТТКТААКАТ ГК	Адгенная плазмида #112686
		908А2	ТТГТТАТТТТААААА ACGATTCATTCTA GGCGATCGCTTA CTTGTACAGCTC ГТККАТГКС
	Перевернутый промоутер Ubiq	908А3	ACCGTGACCTAC АТЦГТКГАКАКТА GTGGATCTCTAGA CGCGCAGATCGC ЦГАТГ	Адгенная плазмида #112686
		908А4	ГГАТКАТАААКТТ TCGAAGTCATGC GGCCGCTCTGCG ГГТКААААТАТАГАГ АТГТ

Таблица 1: Список молекулярных конструкций и праймеров, используемых в данном исследовании. Этот список включает в себя все конструкции (как идентификатор, так и описание) и связанные с каждой конструкцией буквари (как идентификатор, так и последовательности (от 5' до 3')) и используемые шаблоны.

Обсуждение

С тремя различными конструкциями применения системы CasRx эта работа продемонстрировала в вивопрограммируемое нацеливание РНК на мух. Различные стратегии удовлетворяют различные потребности проекта, такие как эндогенное и экзогенное нацеливание на гены и повсеместное и тканеспецифическое нацеливание на РНК. Эффекты нацеливания на РНК включали специфические фенотипические изменения целевого гена, снижение транскрипта целевой РНК и случайные фенотипы летальности, связанные с высокой экспрессией белка CasRx и коллатеральной активностью. В целом, эти результаты показали, что система CasRx способна целенаправленное снижение транскрипта РНК на уровне организма программируемым и эффективным образом.

Одним из ключевых факторов успешной настройки системы CasRx является проектирование гРНК. В частности, следует учитывать следующие рекомендации: целевая последовательность составляет около 30 нуклеотидов в длину, длина поли-U растяжек в целевой последовательности составляет 4 пары оснований или менее, содержание GC целевой последовательности находится в диапазоне 30% - 70%, целевая последовательность не прогнозируется для формирования сильных структур шпильки РНК, а целевая последовательность содержит минимальную прогнозируемую вторичную или третичную структуру ^РНК5.

В дополнение к конструкциям гРНК, шаг генетики мух в каждом протоколе также имеет решающее значение для успешной реализации. Наличие или отсутствие определенных фенотипов, передаваемых от родителей в потомствах, важно для идентификации и количественной оценки фенотипов, индуцированных системой CasRx у трансгетерозиготных потомков. Кроме того, настройка контрольных скрещиваний с использованием мух dCasRx параллельно также полезна для исключения неспецифических фенотипов у трансгетерозиговых потомков.

Стоит отметить, что эти результаты выявили проблему токсичности, вызванную повсеместной экспрессией белка CasRx и dCasRx в мухе, что является ограничением системы CasRx. Повсеместная экспрессия CasRx или dCasRx только под промотором Ubiq, без гРНК, сопровождалась нетривиальными затратами на приспособленность, поскольку ни мухи Ubiq-CasRx, ни Ubiq-dCasRx не могли быть установлены как гомозиготные линии. Напротив, мухи UASt-CasRx и UASt-dCasRx могут быть установлены как здоровые гомозиготные запасы, хотя из-за конструкции кросс-схемы они были сохранены как двойные сбалансированные запасы, что подтверждает существование токсичности, вызванной повсеместной экспрессией белка CasRx. Еще одно подтверждающее доказательство заключается в том, что в контрольных экспериментах с участием dCasRx, который каталитически неактивен, процент мух, несущих как dCasRx, так и гРНК-конструкции из общего числа мух в поколении _F1, был последовательно ниже 50%, соотношение, ожидаемое на основе менделевской генетики, если не было токсичности, связанной с dCasRx. Это указывало на то, что повсеместно экспрессирующая dCasRx вместе с гРНК вызывает токсичность у мухи, что приводит к меньшему, чем ожидалось, соотношению наследования. Коэффициенты наследования трансгетерозиготных мух UASt-dCasRx, gRNA, GAL4 следовали менделевской генетике, что еще раз указывает на токсичность, вызванную именно повсеместной экспрессией белков CasRx и dCasRx. Токсичность в системе CRISPR/Cas не нова. Было показано, что большое количество белка Cas9 токсично в нескольких организмах, включая мух29,30,31,32. Недавнее исследование разработало индивидуальную систему GAL4 / UAS, которая может настраивать количество белка Cas9, экспрессируемого в мухах, добавляя открытый кадр считывания различной длины между последовательностью UAS и последовательностью Cas9 в конструкции UAS-Cas933. Поэтому стоит изучить способы снижения токсичности, вызванной CasRx, путем настройки уровня экспрессии белка CasRx.

Помимо токсичности, вызванной повсеместной экспрессией белков CasRx и dCasRx, результаты также показали летальность, связанную с неспецифическими побочными эффектами системы CasRx вне цели, что характерно для многих систем CRISPR1,2,7,34. У некоторых CasRx и несущественных генов гРНК-экспрессирующих двойных или тройных трансгетерозиговых мух, например, при нацеливании на Notch, трансгетерозиготные мухи CasRx имеют значительно более низкие уровни выживаемости по сравнению с трансгетерозгическими мухами dCasRx. В анализе RNA-seq этих CasRx и гРНК-экспрессирующих трансгетерозиготных мух наблюдалось как снижение уровней транскриптов генов-мишеней, так и снижение транскриптов нецелевых генов. Эти побочные эффекты были CasRx-зависимыми и целевыми, поскольку они наблюдались только у трансгетерозиготных мух, экспрессирующих как белок CasRx, так и гРНК. Стоит отметить, что один из генов-мишеней, белый, показал лишь ограниченное, нестатистически значимое снижение транскриптов, когда белый ген был нацелен casRx, что контрастировало с четким фенотипом восстановления пигмента. Предполагается, что это может быть связано с тем, что 1) сроки сбора образцов РНК-seq не были хорошо согласованы со сроками, когда белый ген достигает своей пиковой экспрессии во время раннего развития, и 2) локализованная экспрессия белого гена в глазах затрудняет сбор соответствующих тканей на ранней стадии развития, когда возможен только сбор образцов всего тела. Чтобы снизить коллатеральную активность в системе CasRx, необходимы будущие исследования, чтобы полностью понять механизмы, лежащие в основе системы нецелевых явлений на уровне организма.

Интересно, что недавнее ^{исследование35} , описывающее инструменты Cas13, нацеленные на РНК у мух, по-видимому, улучшает общую токсичность, связанную с экспрессией CasRx, по нескольким возможным причинам. Во-первых, авторы перекодировали трансгены Cas13 для оптимизации экспрессии у дрозофилы и использовали более слабо экспрессирующий промотор (актин 5C) по сравнению с промотором убиквитина, используемым в настоящем исследовании, что, вероятно, привело к снижению уровня экспрессии Cas13 и, следовательно, меньшей токсичности. Действительно, это подтверждается наблюдениями о том, что экспрессия CasRx и dCasRx, управляемая UASt, сама по себе не была токсичной, поскольку это исследование (и авторы в ³⁵) не наблюдали какой-либо очевидной летальности у мух UASt-CasRx. Кроме того, эти авторы кодировали свои гРНК по-разному по сравнению с этим исследованием, что, возможно, повлияло на их экспрессию и снизило токсичность системы у трансгетерозиготных мух Cas13 / gRNA. Например, в их исследовании две гРНК были экспрессированы с использованием промотора U6: 3 и окружены тРНК, чтобы обеспечить обработку гРНК при созревании тРНК без необходимости ^CasRx35. И наоборот, в этом исследовании гРНК были закодированы как массивы, нацеленные на до 4 мест на ген и имитирующие эндогенную структуру массива Cas13, обнаруженную у бактерий, которая требует фермента Cas13 для обработки каждой гРНК. Эти различные подходы, возможно, привели к различиям в уровнях экспрессии гРНК и других факторах, которые могут оказывать неотъемлемое влияние на токсичность всей системы. Наконец, Huynh et al. нацелились на гены, отличные от тех, которые были нацелены в настоящем исследовании, что приводит к различиям во взаимодействии мишени Cas / gRNA и коллатеральной активности и может оказывать влияние на наблюдаемые уровни летальности. Эти различия в наблюдаемой токсичности требуют дальнейшего изучения для выявления способов улучшения общих систем.

В целом, это исследование является первой демонстрацией функциональной генетически закодированной программируемой системы Cas, нацеленной на РНК, в D. melanogaster, хотя дальнейшая оптимизация системы CasRx (в соответствии с тем, что ^{сообщается35}) потребуется для дальнейшего снижения летальности вне цели и повышения эффективности расщепления CasRx на цели. РНК-таргетинг с ферментами Cas является быстро развивающейся областью со многими потенциальными приложениями, начиная от борьбы с насекомыми-переносчиками до терапевтического использования1,2,3,4,5,6,7, и этот протокол предлагает стартовый пакет для всех, кто заинтересован в разработке своей первой системы CasRx на мухах, будучи совместимым с настройкой и дальнейшей оптимизацией системы. Примеры, представленные здесь, демонстрируют ряд результатов, с которыми можно столкнуться при внедрении этой системы in vivo, и могут служить ориентирами для других пользователей при оценке производительности системы CasRx в их приложениях.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% Grape Juice	Welch Foods Inc.	N/A
Active Dry Yeast (908g)	Red Star Yeast Company, LLC	N/A
DMC4500 color camera	Leica Microsystems	DMC4500
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1910
GAL4-GMR flies	Bloomington Drosophila Stock Center	29967
GAL4-y flies	Bloomington Drosophila Stock Center	44373
Glomax 20/20 Luminometer	Promega	E5331
Illumina HiSeq2500 Sequencer	Illumina, Inc.	HiSeq2500
M165FC fluorescent stereomicroscope	Leica Microsystems	M165FC
Nanodrop OneC UV-vis spectrophotometer	ThermoFisher	NDONEC-W
NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit	New England Biolabs, Inc.	E7770
plasmid # 112686	Addgene	112686
plasmid # 112688	Addgene	112688
plasmid # 132416	Addgene	132416
plasmid # 132417	Addgene	132417
plasmid # 132419	Addgene	132419
plasmid # 132420	Addgene	132420
plasmid # 132421	Addgene	132421
plasmid # 132422	Addgene	132422
plasmid # 132425	Addgene	132425
plasmid # 132426	Addgene	132426
plasmid # 133304	Addgene	133304
plasmid # 164586	Addgene	164586
plasmid #132418	Addgene	132418
plasmid pJFRC81	Addgene	36432
Qiagen RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
Restriction endonucleases AscI	New England Biolabs Inc.	R0558L
Restriction endonucleases NotI	New England Biolabs Inc.	R0189L
Restriction endonucleases PacI	New England Biolabs Inc.	R0547L
Restriction endonucleases PstI	New England Biolabs Inc.	R0140L
Restriction endonucleases SwaI	New England Biolabs Inc.	R0604L
Restriction endonucleases XbaI	New England Biolabs Inc.	R0145L
RNA 6000 Pico Kit for Bioanalyzer	Agilent Technologies	5067-1513
Turbo DNase	Invitrogen	AM2238
U6-3:4-gRNA-Fluc flies	Bloomington Drosophila Stock Center	84125
U6-3:4-gRNA-GFP; OpIE2-GFP flies	Bloomington Drosophila Stock Center	84986
U6-3:4-gRNA-N flies	Bloomington Drosophila Stock Center	84122
U6-3:4-gRNA-w flies	Bloomington Drosophila Stock Center	84124
U6-3:4-gRNA-y flies	Bloomington Drosophila Stock Center	84123
UASt-CasRx flies	Bloomington Drosophila Stock Center	84121
UASt-dCasRx flies	Bloomington Drosophila Stock Center	84120
Ubiq-CasRx flies	Bloomington Drosophila Stock Center	84118
Ubiq-dCasRx flies	Bloomington Drosophila Stock Center	84119
Ubiq-Firefly-T2A-eGFP-Ubiq-Renilla flies	Bloomington Drosophila Stock Center	84127
Zymoclean Gel DNA Recovery Kits	Zymo Research Corporation	D4007