Method Article
Чтобы продвинуться вперед, конусы роста должны оказывать тяговые силы против внешней среды. Генерация тяговых сил зависит от динамики актина и сцепления сцепления. В настоящем исследовании описаны методы анализа динамики актина, сцепления сцепления и тяговых сил для продвижения конуса роста.
Чтобы создать функциональные сети, нейроны должны мигрировать в соответствующие места назначения, а затем расширять аксоны к своим клеткам-мишеням. Эти процессы зависят от продвижения ростовых колбочек, которые расположены на кончиках нейритов. Аксональные конусы роста генерируют движущие силы, ощущая их локальное микроокружение и модулируя динамику цитоскелета и актин-адгезионную связь (сцепление). Десятилетия исследований привели к идентификации направляющих молекул, их рецепторов и нисходящих сигнальных каскадов для регулирования миграции нейронов и аксонального руководства; однако молекулярные механизмы, необходимые для генерации сил для продвижения конуса роста и навигации, только начинают выясняться. На переднем крае колбочек роста нейронов актиновые нити подвергаются ретроградному потоку, который питается полимеризацией актина и сокращением актизина. Муфта сцепления между ретроградным потоком F-актина и адгезивной подложкой создает тяговые силы для продвижения конуса роста. В настоящем исследовании описывается подробный протокол мониторинга ретроградного потока F-актина с помощью однокрапчатой визуализации. Важно отметить, что в сочетании с маркером F-актина Lifeact этот метод может количественно оценить 1) скорость полимеризации F-актина и 2) эффективность связи сцепления между ретроградным потоком F-актина и адгезивной подложкой. Оба являются критическими переменными для создания сил для продвижения конуса роста и навигации. Кроме того, настоящее исследование описывает подробный протокол микроскопии силы тяги, который может количественно оценить 3) тяговую силу, генерируемую конусами роста. Таким образом, объединив анализ односпеклевой визуализации и микроскопии силы тяги, исследователи могут контролировать молекулярную механику, лежащую в основе продвижения конуса роста и навигации.
В развивающемся мозге позвоночных нейроны подвергаются тщательно организованным миграциям и проецируют аксоны к соответствующим синаптическим партнерам для создания функциональных нейронных сетей1,2,3. Ростовые колбочки, представляющие собой сенсорные и подвижные структуры, расположенные на кончике нейритов, определяют скорость и направление миграции нейронов и роста аксонов3,4,5. Поскольку нейроны окружены плотно упакованными средами, ростовые колбочки должны оказывать силы против окружающей среды, чтобы двигаться вперед6,7. Чтобы понять механизмы, лежащие в основе миграции нейронов и аксонального руководства, необходим анализ молекулярной механики для продвижения конуса роста.
Десятилетия анализа показали, что тяговая сила для стимулирования продвижения конуса роста генерируется механизмом «сцепления»; считается, что этот механизм функционирует не только в аксональном конусе роста, но и в конусе роста ведущего процесса мигрирующих нейронов8,9,10,11,12. А именно, актиновые нити (F-актины) в ростовых шишках полимеризуются на переднем крае и деполимеризуются проксимально, выталкивая переднюю мембрану13,14,15. Результирующая сила в сочетании с сокращением актомиозина индуцирует движение F-актинов назад, называемое ретроградным потоком7,11,16,17,18,19,20,21. Молекулы сцепления и клеточной адгезии опосредуют механическую связь между ретроградным потоком F-актина и адгезивной подложкой и передают силу потока F-актина на подложку, тем самым создавая тяговое усилие для продвижения конуса роста7,8,9,11,12,22 . Одновременно связь актин-подложка снижает скорость потока F-актина и преобразует полимеризацию актина в силу, при которой выступает передняя мембрана9,10.
Аксональные конусы роста воспринимают локальные химические сигналы и преобразуют их в направленную движущую силу для навигации по конусу роста3,23,24,25. Например, аксонная направляющая молекула нетрин-1 стимулирует свой рецептор, удаленный при колоректальном раке (DCC), и активирует Rho guanosine triphosphate (GTP)-связывающие белки клеточного деления белка 42 (Cdc42) и ras-связанного субстрата ботулинического токсина C3 1 (Rac1) и их последующую киназу p21-активированную киназу 1 (Pak1)26. Cdc42 и Rac1 способствуют 1) полимеризации актина, а Pak1 фосфорилирует молекулу сцепления shootin122,26. Shootin1 взаимодействует с ретроградным потоком F-актина через актин-связывающий белок кортактин27. Shootin1 также взаимодействует с молекулой адгезии клеток L1 (L1-CAM)20,24. Фосфорилирование Shootin1 увеличивает сродство связывания кортактина и L1-CAM и усиливает shootin1-опосредованное 2) сцепление 24,27. Внутри конуса роста асимметричные активации полимеризации актина и сцепления увеличивают 3) тяговое усилие на стороне источника нетрина-1, тем самым генерируя направленную движущую силу для поворота конуса роста (рисунок 1)24. Интенсивные исследования за последние несколько десятилетий в отношении миграции нейронов и руководства аксонами улучшили понимание направляющих молекул, их рецепторов и связанных с ними нисходящих сигнальных каскадов2,10,28,29,30. Однако молекулярные механизмы для создания сил для продвижения конуса роста только начинают проясняться; это может быть связано с ограниченным использованием протоколов механобиологического анализа.
В настоящем исследовании описывается подробный протокол мониторинга ретроградного потока F-актина с помощью односпеклической визуализации16,18. Мониторинг ретроградного потока F-актина широко проводился с использованием микроскопии сверхвысокого разрешения, конфокальной микроскопии со спиннинговым диском и флуоресценции полного интерференционного отражения (TIRF)25,31,32,33,34,35,36,37,38 . Протокол в настоящем исследовании, однако, использует стандартный эпифлуоресцентный микроскоп и, таким образом, легко принимается11,16,18,20,22,23,24,27,39,40,41,42. В сочетании с маркировкой F-актина Lifeact43 однокрапчатая визуализация позволяет количественно оценить скорость полимеризации актина и эффективность связи сцепления между ретроградным потоком F-актина и адгезивной подложкой39,42. В настоящем исследовании далее описывается подробный протокол тракционной силовой микроскопии с использованием флуоресцентного полиакриламида (PAA) геля11,22,23,24,27,39,41,42,44. Этот метод обнаруживает и количественно оценивает тяговую силу под конусом роста путем мониторинга движений бусин, вызванных силой44,45. Приведен код анализа тяговой силы с открытым исходным кодом, а также подробно объяснен метод количественной оценки тяговой силы во время миграции конуса роста. С помощью однокрапчатой визуализации и микроскопии силы тяги будет облегчено понимание молекулярной механики, лежащей в основе миграции конуса роста и навигации. Эти методы также применимы для анализа молекулярной механики, лежащей в основе дендритного увеличения позвоночника, что, как известно, важно для обучения и памяти42.
Все эксперименты с использованием лабораторных животных проводились с Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Института науки и техники Нара. Исследователи должны следовать установленным руководящим принципам своих институциональных и национальных комитетов по регулированию животных в отношении ухода за лабораторными животными и их использования.
1. Подготовка растворов и сред
2. Получение подложек с поли-D-лизином (PDL)/ламининовым покрытием
3. Рассечение и диссоциация гиппокампа
4. Трансфекция и культивирование нейронов
5. Однокрапчатая визуализация на конусах роста нейронов
6. Количественная оценка скорости потока F-актина и скорости полимеризации с использованием программного обеспечения для обработки и анализа изображений Fiji
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к Дополнительному файлу 3 для получения практических данных для количественной оценки скорости потока F-актина и скорости полимеризации актина.
7. Приготовление геля PAA для тракционной силовой микроскопии и культур нейронов
8. Тракционная микроскопия на колбочках роста нейронов
Однокрапчатая визуализация для количественной оценки скорости полимеризации актина и эффективности соединения сцепления
Экспрессия с высоким содержанием Lifeact позволяет визуализировать F-актин в конусе роста; низкая экспрессия HaloTag-актина позволяет контролировать ретроградный поток F-актина (рисунок 3, дополнительный файл 2). Трассировка актиновых пятен позволяет измерить скорость потока F-актина (рисунок 3C,D). Поскольку механическая связь ретроградного потока F-актина и адгезивной подложки снижает скорость потока F-актина, эффективность сцепления сцепления может быть оценена по скорости. Кроме того, маркировка F-актина с помощью Lifeact облегчает визуализацию расширения F-актина и полезна для количественной оценки скорости полимеризации актина (рисунок 3E, F).
Количественный анализ тяговой силы
Строгое соблюдение представленной здесь методики позволит выявить движения флуоресцентных шариков под конусом роста (рисунок 6С, дополнительный файл 4). Ретроградный поток F-актина на подложку генерирует тяговую силу, заставляя флуоресцентные шарики двигаться назад под конусом роста. Код анализа тяговой силы оценивает тяговую силу от флуоресцентного смещения шарика и выражает рассчитанную тяговую силу как вектор силы. Направление и величина силы тяги определяются из x- и y-компонентов вектора силы (рис. 8C,D). Красное поле на рисунке 8D представляет x- и y-компоненты вектора силы; На рисунке 8C изображен соответствующий конус роста. В терминах координат x-y вектор указывает на -93,8° против оси x; эта ориентация направлена к задней части конуса роста (рисунок 8C). Величина тягового усилия F была рассчитана следующим образом:
Рисунок 1: Механизм конуса роста для генерации силы и навигации по конусу роста. Градиент хемоаттрантата нетрина-1 индуцирует асимметричную стимуляцию его рецептора DCC на конусе роста аксонала. Это активирует Rac1 и Cdc42, а также их нисходящую киназу Pak1. Rac1 и Cdc42 способствуют (1) полимеризации актина, тогда как Pak1 фосфорилатирует shootin1, усиливая shootin1-опосредованную (2) муфту сцепления. Асимметричная активация динамики актина и сцепления сцепления внутри конуса роста увеличивает (3) тяговое усилие на стороне источника нетрина-1, тем самым генерируя направленную движущую силу для притяжения конуса роста. Представленные здесь протоколы позволяют количественно оценить ключевые переменные (1)-(3) для навигации по конусу роста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Флуоресцентные изображения конуса роста нейронов под полностью открытой и суженной диафрагмой. Ростовый конус экспрессирует Lifeact и HaloTag-актин. (A) Экспрессия high Lifeact позволяет визуализировать морфологию конуса роста. С другой стороны, уровни экспрессии HaloTag-актина очень низкие, с тусклыми сигналами, когда диафрагма полностью открыта. (B) Когда диафрагма соответствующим образом сужена, фоновые сигналы уменьшаются, и в конусе роста появляются одиночные актиновые пятнышки. Шкала: 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Этапы количественной оценки скорости потока F-актина и скорости полимеризации актина с использованием программного обеспечения для обработки и анализа изображений Fiji. (A) Отрегулируйте угол изображения для анализа. (1) Найдите и выберите актиновое пятнышко (наконечник стрелки), которое течет в пучке F-актина. (2) Выберите Изображение > Преобразовать > Повернуть. (3) Установите угол так, чтобы пучок F-актина был направлен вверх. (4) Угол изображения будет изменен. (B) Разграничить область, включая актиновое пятнышко и F-актиновый пучок. (1) Нажмите на Прямоугольник на панели инструментов. (2) Очертите область на изображении. Яркость и контрастность изображения увеличены, чтобы обеспечить четкую визуализацию актинового пятнышка и кончика пучка F-актина. (3) Выберите Изображение > Дубликат. (4) Введите пять таймфреймов, которые показывают поток актиновых пятен в пучке F-актина. (5) Выбранное изображение стека появится на экране. (C) Наложенные круги на актиновое пятнышко. (1) Нажмите на Овал на панели инструментов. (2) Нарисуйте круг на актиновом пятнышке. (3) Выберите наложение > изображений > добавить выделение. (4) Круг накладывается. 5) Повторите наложение кругов на оставшиеся актиновые пятнышки. (D) Измерение расстояния транслокации актиновых пятен в течение пяти временных интервалов. (1) Нажмите прямо на панели инструментов. (2) Проведите линию, которая связывает центры кругов. (3) Выберите «Анализировать > меру». Результат, обозначаемый параметром Height (красный прямоугольник), ретранслирует расстояние транслокации актиновых пятен. (E) Измерить изменение длины протрузии F-актина в течение пяти временных интервалов. (1) Проведите линию, которая связывает кончики F-актинового выступа. (2) Выберите Анализировать > меру. Результат (красное поле), Высота, указывает длину расширения пучка F-актина. (F) Скорость полимеризации актина рассчитывается из суммы скорости потока F-актина и скорости расширения. См. также Дополнительный файл 2. Дополнительный файл 3 помогает исследователям практиковать методологию, описанную выше. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Этапы приготовления геля PAA. Подробное описание см. в шаге 7.1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Определение жесткости геля PAA. (A) Метод углубления микросферы. Когда микросфера помещается на флуоресцентный гель PAA, встроенный в шарики, вес микросферы вызывает углубление в геле. Глубина отступа рассчитывается путем вычитания z-положений поверхности геля PAA со дна микросферы (B,C) Флуоресцентные изображения геля PAA, вдавленного микросферой и содержащего флуоресцентные шарики. Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп использовался для захвата изображений поверхности геля (B) и дна микросферы (C). Сигналы от флуоресцентных шариков не видны на поверхности геля в области отступа (В, круг). Однако их можно наблюдать на дне микросферы. Шкала: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Силовое картирование конуса роста нейронов. (А-С) Флуоресцентные изображения бусин, встроенных в гель PAA и нейронный конус роста, визуализированный с помощью EGFP. После получения покадровых изображений (A) нейрон освобождали из гелевой подложки путем нанесения раствора SDS, и было получено изображение шариков в ненапряженной подложке (B). (C) На изображении бусин в ненапряженной подложке видны бусины в их первоначальном (зеленом) и смещенном (красном) положениях. Сигнал EGFP конуса роста показан синим цветом. Кимографы (справа) показывают движения бусин с интервалом 3 с в течение 147 с, обозначенные стрелками в коробочных областях 1 и 2. Бусина в области 2 является эталонной бусиной. Шкала: 2 мкм для (A), (B) и (C, слева) и 1 мкм для (C, середина). См. также Дополнительный файл 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Этапы коррекции положения бусины x-y в ненапряженной подложке с использованием Фиджи. (A) Сцепите изображение бусины в ненапряженной подложке с покадровым изображением флуоресцентных бусин. (1) Выберите Стеки > изображений > Инструменты > Объединить. (2) Выберите изображение бусин в ненапряженной подложке и покадровое стековое изображение флуоресцентных бусин в Image1 и Image2 соответственно. Нажмите OK. (3) Изображение бусины в ненатянутой подложке добавляется к покадровому стековому изображению. (B) Коррекция положения x-y флуоресцентного изображения шарика. (1) Используйте полосу прокрутки (красная рамка) для выбора второго фрейма (красная стрелка) в стеке изображений. (2) Выберите Плагины > StackReg. (3) Выберите Твердое тело из выпадающего списка (красная рамка) и нажмите OK. Начнется коррекция положения x-y. (C) Сохраните изображение бусины с коррекцией положения x-y. После выбора первого кадра изображения стека с коррекцией положения x-y (1) выберите «Изображение > дублировать». (2) введите 1 в диапазон и снимите флажок Дублировать стек. Затем нажмите OK. (3) на экране появится изображение бусины с коррекцией положения x-y в ненапряженной подложке. Сохраните это изображение в виде файла tiff. Дополнительный файл 6 помогает исследователям практиковать методологию, описанную выше. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Анализ силы тяги под конусом роста нейронов с использованием кода анализа тяговой силы с открытым исходным кодом. (A) GUI для анализа силы тяги. Покадровые изображения, выбранные в графическом интерфейсе, могут быть подтверждены из выпадающего списка и с помощью указанного ползунка (красное поле). (B) Выберите регион, включающий конус роста. (1) Нажмите на ROI на графическом интерфейсе. Курсором мыши укажите две точки (наконечники стрелок) на изображении ячейки. (2) На изображении ячейки появится красное поле. Два клика определяют расположение двух углов. (C) Выберите обнаруженные бусины (белые точки) под конусом роста. (1) На графическом интерфейсе нажмите выбрать бусины и разграничите полигональную область, которая включает в себя конус роста, щелкнув мышью. Нажмите клавишу Enter . (2) Белые точки в полигональной области превратятся в красный цвет. D) Рассчитанные результаты направления и величины тяговой силы. Красное поле в электронной таблице представляет x- и y-компоненты вектора силы, оцененные с помощью анализа тяговой силы. На координате x-y в правой панели вектор силы, генерируемый конусом роста, указывает на -93,8° против оси x; эта ориентация направлена к задней части конуса роста в (C). Дополнительный файл 6 помогает исследователям практиковать методологию, описанную выше. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: Рецепты растворов и сред, используемых в этом исследовании. Подробное использование см. в тексте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 2: Флуоресцентная визуализация Lifeact и флуоресцентная спекл-визуализация HaloTag-актина в конусе роста нерва. Лайфакт (зеленый) и ГалоТаг-актин (пурпурный). Изображения были получены каждые 3 с в течение общей продолжительности 147 с. Шкала: 2 мкм. Смотрите также рисунок 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 3: Практические данные для количественной оценки скорости потока F-актина и скорости полимеризации актина. Многоканальное покадровое стековое изображение Lifeact (зеленый) и HaloTag-actin (пурпурный). См. также рисунок 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 4: Видео с отображением силы, определяющее тяговую силу на конусе роста нейронов. Исходное (зеленое) и смещенное (красное) положение бусин. Сигнал EGFP в конусе роста показан синим цветом. Изображения приобретались каждые 3 с в течение 147 с. Шкала: 2 мкм. См. также рисунок 6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 5: Код анализа тягового усилия. Пожалуйста, смотрите Шаг 8.12 для подробного использования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 6: Практические данные для количественной оценки тяговой силы. Одноканальное RGB-изображение бусин в ненапряженной подложке и одноканальное покадровое стековое RGB-изображения флуоресцентных бусин под конусом роста, EGFP и ярким полем. см. также рисунки 7 и 8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Протоколы, описанные в этом исследовании, используют коммерчески доступные материалы и оборудование для микроскопии, обычно встречающееся во всех лабораториях, институтах и университетах. Таким образом, исследователи могут легко принять нынешнюю однопятнистую визуализацию и микроскопию силы тяги в своих исследованиях.
Спекл-визуализация может анализировать полимеризацию актина и муфту сцепления. Кроме того, спекл-визуализация может контролировать ретроградный поток молекул сцепления, таких как shootin1 и кортактин, которые взаимодействуют с ретроградным потоком F-актина. С помощью микроскопа TIRF можно также контролировать ретроградный поток молекулы клеточной адгезии L1-CAM23,41; L1-CAM подвергается сцеплению и скольжению, которое отражает эффективность сцепления сцепления23,41. Хотя в настоящем исследовании используется система TMR-HaloTag для спекл-визуализации, другие флуоресцентные белки, такие как EGFP и мономерный красный флуоресцентный белок, также доступны в анализе16,18,20,23,24,27,39. Основными условиями для визуализации актиновых пятен являются низкий уровень экспрессии флуоресцентного актина и освещенность минимальной площади (рисунок 2). В этом протоколе последовательно приобретаются сигналы Lifeact и HaloTag-actin. Поскольку ретроградный поток актина относительно медленный (4,5 ± 0,1 мкм/мин)24, анализ ретроградного потока F-актина и полимеризации актина не зависит от последовательного получения изображения различных флуоресцентных каналов (интервал ~ 1 с). Lifeact является широко используемым маркером F-актина, но может конкурировать с актин-связывающими белками47. Кроме того, Lifeact может изменять динамику актина, тем самым влияя на структуры F-актина и морфологию клеток47,48,49.
Микроскопия тяговой силы может обнаруживать силы, стимулирующие продвижение конуса роста. Устанавливая нейроны во внеклеточном матриксе, исследователи также могут анализировать силы, генерируемые в полу-3D-среде11. Визуализация с высоким увеличением важна для точной количественной оценки силы тяги, поскольку конусы роста генерируют слабые тяговые силы7. Хотя другие методы с нанопилларами или стресс-чувствительными биосенсорами также используются для измерения силы тяги50,51, метод на основе геля PAA обладает высокой степенью адаптации и позволяет регулировать жесткость подложки путем изменения концентраций акриламида и бис-акриламида41,44,52. В этом протоколе гель PAA готовят в конечной концентрации 3,75% акриламида и 0,03% бис-акриламида; Модуль Юнга составляет ~ 270 Pa22, и эта жесткость находится в диапазоне мозговой ткани (100-10 000 Па) 53,54,55. Из-за толщины геля PAA (~ 100 мкм) этот метод ограничивает использование линз с высоким увеличением во время микроскопии. Чтобы получить изображения с высоким увеличением, исследователи должны использовать функцию масштабирования в лазерном сканирующем конфокальном микроскопе.
В заключение, существующая спекл-визуализация и микроскопия силы тяги позволяют проводить количественный анализ ключевых событий в силовых поколениях. Эта информация будет иметь неоценимое значение для улучшения понимания механизмов, лежащих в основе продвижения конуса роста и навигации.
Авторам нечего раскрывать.
Это исследование было частично поддержано AMED под номером гранта 21gm0810011h0005 (N.I. и Y.S.), JSPS KAKENHI (JP19H03223, N.I.) и JSPS Grants-in-Aid for Early-Career Scientists (JP19K16258, T.M.), Osaka Medical Research Foundation for Inzable Diseases (T.M.) и NAIST Next Generation Interdisciplinary Research Project (Y.S.).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.5% trypan blue stain solution | Nacalai | 29853-34 | |
3-aminopropyltrimethyoxysilane | Sigma | 281778-100ML | |
Acrylamide monomer | Nacalai | 00809-85 | |
Ammonium persulphate | Cytiva | 17-1311-1 | |
Axio Observer Z1 | Zeiss | 431007-9902-000 | Epi-fluorescence microscope (single speckle imaging) |
B-27 supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
Bovine serum albmine | Sigma | A7906-10G | |
C-Apochromat 63x/1.2 W Corr | Zeiss | 421787-9970-799 | Objective lens (traction force microscopy) |
Coverslip (diameter 18 mm) | Matsunami | C018001 | |
D-glucose | Nacalai | 16806-25 | |
DNaseI | Sigma | DN25-100MG | |
Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
Fiji | Open source software package | https://imagej.net/software/fiji/ | |
FluoSpheres carboxylate-modified 0.2 mm, red (580/605), 2% solid | Thermo Fisher Scientific | F8810 | carboxylate-modified microspheres |
Glass bottom dish (14 mm diameter) | Matsunami | D1130H | |
Glass bottom dish (27 mm diameter) | Matsunami | D1140H | |
Glutaraldehyde solution | Sigma | G5882-10X10ML | |
HaloTag TMR ligand | Promega | G8251 | |
HBO103 W/2 | Osram | 4050300382128 | Mercury lamp (single speckle imaging) |
Image Processing Toolbox | MathWork | https://www.mathworks.com/products/image.html | |
Laminin solution from mouse EHS tumor | Wako | 120-05751 | |
Leibovitz’s L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
L-glutamine | Nacalai | 16919-42 | |
LSM710 | Zeiss | N/A | Conforcal laser microscope (traction force microscopy) |
MATLAB2018a | MathWork | https://www.mathworks.com/products/new_products/release2018a.html | |
Mouse C57BL/6 | Japan SLC | N/A | |
Mouse neuron nucleofector kit | Lonza | VPG-1001 | |
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai | 33401-72 | |
N,N’-methylenebisacrylamide | Nacalai | 22402-02 | |
Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
Nucleofector I | Amaxa | AAD-1001 | Electroporation apparatus |
ORCA Flash 4.0 V2 | Hamamatsu | C11440-22CU | CMOS camera (single speckle imaging) |
Papain | Nacalai | 26036-34 | |
Parallel Computing Toolbox | MathWork | https://www.mathworks.com/products/parallel-computing.html | |
pEGFP-C1 | Clontech | 1528177 | |
Penicillin-streptomycin (100x) | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
pFN21A-HaloTag-actin | (Minegishi et al., 2018) | N/A | |
Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011-044 | |
Plan-Apochromat 100x/1.4 Oil | Zeiss | 420790-9901-000 | Objective lens (single speckle imaging) |
pmNeonGreen-N1-Lifeact | (Kastian et al., 2021) | N/A | |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P6407-5MG | |
Slulfo-SAMPHA | Thermo Fisher Scientific | 22589 | |
Sodium dodecyl sulfate | Nacalai | 08933-05 | |
Sodium hydrate (NaOH) | Nacalai | 31511-05 | |
Steel ball | Sako tekkou | N/A | Microshpere to determin PAA gel rigidity. 0.6 mm diameter, 7.87 g/cm3. |
ZEN2009 | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction | Image acquisition software (traction force microscopy) |
ZEN2012 | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction | Image acquisition software (single speckle imaging) |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены