Оценка кишечного трансцитоза изолятов бактериемии новорожденных Escherichia coli

Резюме

Кишечная палочка вызывает сепсис у новорожденных, которые глотают бактерии во время рождения. Процесс, связанный со способностью кишечной палочки перемещаться из кишечнорастворимого тракта в кровоток, плохо изучен. Эта модель in vitro оценивает способность штаммов E. coli путешествовать через эпителиальные клетки кишечника.

Аннотация

Новорожденные глотают материнские штаммы E. coli , которые колонизируют их кишечный тракт во время родов. Штаммы E. coli со способностью перемещаться по кишечнику вторгаются в кровоток новорожденного, вызывая опасную для жизни бактериемию. Методология, представленная здесь, использует поляризованные эпителиальные клетки кишечника, выращенные на полупроницаемых вставках, для оценки трансцитоза изолятов бактериемии E. coli новорожденных in vitro. Этот метод использует установленную линию клеток кишечника T84, которая обладает способностью расти до слияния и образовывать плотные соединения и десмосомы. После достижения слияния зрелые монослои T84 развивают трансэпителиальное сопротивление (TEER), которое можно количественно оценить с помощью вольтметра. Значения TEER обратно коррелируют с параклеточной проницаемостью внеклеточных компонентов, включая бактерии, через монослой кишечника. Трансклеточный проход бактерий (трансцитоз), с другой стороны, не обязательно изменяет измерения TEER. В этой модели прохождение бактерий через кишечный монослой количественно оценивается на срок до 6 ч после заражения, и повторные измерения TEER производятся для мониторинга параклеточной проницаемости. Кроме того, этот метод облегчает использование таких методов, как иммуноокрашивание, для изучения структурных изменений в плотных соединениях и других белках клеточной адгезии во время бактериального трансцитоза через поляризованный эпителий. Использование этой модели способствует характеристике механизмов, с помощью которых неонатальная трансцитоза E. coli через эпителий кишечника вызывает бактериемию.

Введение

Кишечная палочка является наиболее распространенной причиной раннего сепсиса у новорожденных ^1,2,3. Смертность от неонатальной бактериемии E. coli может достигать 40%, а менингит является возможным осложнением, которое связано с тяжелыми нарушениями развития нервной^{системы2}. Прием внутрь материнских штаммов кишечной палочки новорожденным может привести к неонатальной бактериемии; этот процесс был воспроизведен на животных моделях ^2,4. После попадания в организм патоге....

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все манипуляции с клетками, бактериями, пластинами и реагентами T84 в шкафу безопасности уровня биобезопасности 2 (BSL-2), чтобы избежать загрязнения. Используйте отдельные области и инкубаторы для всей работы с участием стерильных клеток T84, инфицированных клеток T84 и E. coli. Клинические изоляты E. coli, протестированные с помощью методов, описанных здесь, были получены в соответствии с руководящими принципами Институционального наблюдательного совета в нашем учреждении ^1,16.

1. Подготовка трансцитозных вставок с Т84-клетками (пример....

Результаты

Рисунок 1: T84 TEER с течением времени. По мере созревания клеточного слоя Т84 на вставке электрическое сопротивление монослоя увеличивается. При TEER не менее 1000 Ω·^см2 клеточный слой достаточ?.......

Обсуждение

Этот метод получен из методов, используемых в гастроэнтерологии и инфекционных заболеваниях²⁰. Модели in vitro кишечного эпителиального барьера были использованы для выяснения механизмов, с помощью которых просветное содержимое взаимодействует с этим соответствующим к.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10,000 U/ mL Penicillin/Streptomycin Mixture	Fisher Scientific	15-140-122
15 mL sterile conical tubes	MidSci	C15B
2 mL microcentrifuge tubes	Avant	AVSS2000
50 mL sterile polypropylene conical tubes	Falcon	352070
Aspirator	Corning	4930
Biosafety Cabinets	Labconco	30441010028343	Three of these are used in the method: one for sterile tissue work, one for infected tissue work, and one for bacterial work.
Centrifuge	Sorvall	Legend RT
Disposable inoculation loops	Fisherbrand	22363605
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-084
Epithelial Volt/Ohm Meter	World Precision Instruments	EVOM
Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	10437028
Ham's F-12 Nutrient Mixture	Gibco	11765-047
Hemacytometer	Sigma Aldrich, Bright Line	Z359629
Incubator shaker	New Brunswick	Innova 4080
Incubators	Thermo Scientific	51030284	Three of these are used in the method: one for sterile tissue culturing, one for infected tissue culturing, and one for bacterial incubation.
Lysogeny broth	Difco	244610
Lysogeny broth agar	IBI Scientific	IB49101
Nikon Eclipse TS2R Microscope	Nikon
Spectrophotometer	Unico	1100RS
T84 Intestinal Cells	American Tissue Culture Collection	CCL248
Tissue culture inserts, with polyethylene trephthalate membrane, 3 µm pores,  24 well format	Falcon	353096
Tissue culture plate, 24 wells	Falcon	353504
Trypan blue stain	Fisher Scientific	T10282