* Эти авторы внесли равный вклад
В этой статье мы предоставляем комплексный протокол для определения начальных локальных сигналов Ca2+ , известных как микродомены Ca2+ , в первичных Т-клетках мыши и человека с помощью флуоресцентной микроскопии. Этот протокол служит ценным ресурсом для исследователей, изучающих сигнальные пути Ca2+ в иммунных клетках и для дальнейшего раскрытия их функции.
Локальные, субсекундные сигналы Ca2+ , называемые микродоменами Ca2+ , представляют собой высокодинамичные и короткоживущие сигналы Ca2+ , которые приводят к глобальному повышению [Ca2+]i и уже могут определять судьбу Т-клеток. При активации Т-клеточных рецепторов NAADP образуется быстро, связываясь с связывающими белками NAADP (HN1L/JPT2, LSM12) и их соответствующими рецепторами (RyR1, TPC2), находящимися во внутриклеточных хранилищахCa2+ , таких как ER и лизосомы, и приводя к последующему высвобождению и повышению [Ca2+]i. Чтобы зафиксировать эти быстрые и динамично возникающие сигналы Ca2+ , мы разработали метод визуализации с высоким разрешением, использующий комбинацию двух индикаторов Ca2+ : Fluo-4 AM и FuraRed AM. Для постобработки был разработан полуавтоматизированный подход к обнаружению микродоменов Ca2+ с открытым исходным кодом на основе языка программирования Python. Используя этот рабочий процесс, мы можем надежно обнаруживать микродомены Ca2+ на субклеточном уровне в первичных мышиных и человеческих Т-клетках в флуоресцентных видео с высоким временным и пространственным разрешением. Этот метод также может быть применен к другим типам клеток, таким как NK-клетки и клеточные линии нейронов мышей.
Представленный метод флуоресцентной микроскопии позволяет визуализировать локальные, временные начальные сигналы кальция (Ca2+) в первичных Т-клетках мыши, называемых микродоменами Ca2+ . Микродомены Ca2+ представляют собой высокодинамичные и короткоживущие сигнальные события Ca2+ , что создает проблемы для эффективной визуализации и анализа живых клеток1.
Т-клетки представляют трудности для визуализации живых клеток из-за относительных различий в интенсивности центральной и периферической флуоресценции, что можно объяснить их сферической формой и небольшим диаметром ~6-8 мкм. После стимуляции и формирования иммунных синапсов Т-клетки претерпевают морфологические изменения, что еще больше усложняет визуализацию Т-клеток1. Таким образом, использование ратиометрического анализа становится обязательным, что достигается либо путем записи двух изображений, представляющих различные свойства красителя Ca2+ , либо использования комбинации двух красителей Ca2+ . К требовательным характеристикам микродоменов Ca2+ относится их быстрая, временная и пространственная ограниченность. Чтобы зафиксировать это, используемые красители Ca2+ должны обладать как высокой базальной яркостью, так и высоким отношением сигнал/шум (SNR) для получения максимально возможного временного и пространственного разрешения. Оптимальные результаты были достигнуты при использовании комбинации двухволнового красителя Fura Red и одноволнового красителя Fluo-4. Совместная загрузка ячеек с Fluo-4 и Fura Red смягчает проблемы, связанные с сильным фотообесцвечиванием красителей с двойной эмиссией и временной задержкой, связанной с красителями с двойным возбуждением, обеспечивая пригодность для быстрого получения изображений. Такой подход еще больше облегчает визуализацию изменений формы и тонких движений. Особые требования также предъявляются к системе формирования изображений с точки зрения пространственного разрешения, позволяющего визуализировать сигналы Ca2+ , исходящие от открытия небольших кластеров каналов или даже отдельных каналов1.
Передача сигналов Ca2+ играет ключевую роль в активации иммунных функций в Т-клетках, включая образование синапсов и выработку и высвобождение цитокинов 2,3. Специфическая судьба клетки регулируется через по-разному выраженные и локально распределенные сигналы Ca2+, микродомены Ca2+ 3. Примечательно, что эти локальные сигналы Ca2+ предшествуют широкому повышению внутриклеточных уровней Ca2+ в Т-клетках, а образование микродоменов Ca2+ зависит как от поступления, так и от высвобождения Ca2+ 1,4,5. При стимуляции Т-клеточными рецепторами (TCR)/CD3 происходит образование вторичных мессенджеров, высвобождающих Ca2+, таких как адениндинуклеотидфосфат никотиновой кислоты (NAADP), D-мио-инозитол 1,4,5-трисфосфат (IP3) и циклическая АДФ-рибоза (cADPR), что приводит к повышению внутриклеточного уровня Ca2+ до 1 мкМ 6,7. Ранние сигнальные события Ca2+ связаны с высвобождением Ca2+ из внутриклеточных хранилищ Ca2+, таких как эндоплазматический ретикулум (ER), при этом такие каналы, как рецептор рианодина 1 (RyR1) и рецептор IP3 (IP3R), являются преимущественно ответственными за эту сигнализацию. Это впоследствии вызывает внеклеточный приток Ca2+ и приводит к глобальному сигналу Ca2+ через управляемый хранилищем вход Ca2+ (SOCE)8. Кроме того, существуют и другие каналы, участвующие в передаче сигналов Ca2+ во время активации Т-клеток9, например, каналы P2X4 и P2X7 обеспечивают аденозинтрифосфат (АТФ)-зависимый приток катионов, способствуя повышению внутриклеточного Ca2+. Примечательно, что первоначальные адгезионно-зависимые микродомены Ca2+ (ADCM) формируются еще до стимуляции TCR, но с более низкими амплитудами и частотами Ca2+. Эти первоначальные TCR-независимые сигналыCa2+, скорее всего, служат миграции Т-клеток к месту воспаления и подготавливают Т-клетки к рестимуляции в месте инфекции10,11.
Разработав описанный метод локальной визуализации Ca2+ , мы получили дополнительный инструмент для изучения происхождения и значения ранних сигналов Ca2+ в активации Т-клеток. Этот метод позволяет пользователю обнаруживать более мелкие, кратковременные и более быстро возникающие сигналы Ca2+ , чем это было возможно ранее. Кроме того, Deconvolution, Analysis, Registration, Tracking, and Shape Normalization (DARTS), конвейер анализа на основе Python, позволяет делиться инструментами анализа с болееширокой аудиторией.
Все эксперименты на животных были одобрены и проведены в соответствии с рекомендациями по благополучию животных Комитета по институциональному уходу за животными и их использованию в Университетской клинике Гамбург-Эппендорф.
1. Выделение первичных Т-клеток мыши из лимфатических узлов и селезенки
2. Отрицательный отбор CD4+ Т-клеток
Примечание: Для отрицательного отбора CD4+ Т-клеток используется набор для выделения Т-клеток, содержащий блокатор FcR, биотинилированные антитела против не-CD4+ Т-клеток и магнитные частицы, покрытые стрептавидином.
3. Загрузка первичных CD4+ Т-клеток мыши
Примечание: Для измерения концентраций свободного цитозольного Ca2+ в экспериментах по визуализации Ca2+ используются флуоресцентные и мембранопроницаемые красители. Комбинация флуо-4-ацетоксиметилового эфира (АМ) и ратиометрического красителя Фура Ред-АМ служит индикатором для быстрого обнаружения локальных сигналов Са2+ . Убедитесь, что вы работаете в темноте при использовании флуоресцентных красителей.
4. Локальная визуализация Ca2+
5. Постобработка / анализ данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обработки изображений и анализа данных используется конвейер с открытым исходным кодом DARTS на основе Python. Он был разработан Woelk et al.12 на основе работы Diercks et al.13.
В этом протоколе мы изложили обновленный метод визуализации и анализа начальных микродоменов Ca2+ в первичных Т-клетках мыши, основанный на предыдущей работе нашей группы 1,13. Этот подход сыграл важную роль в раскрытии участия каналов CRAC, таких как ORAI1, STIM1 и STIM2, а также внутриклеточных каналов высвобождения Ca2+, таких как RyR1, в ранних сигнальных событиях Ca2+ 4.
Для этого мы исследовали спонтанное образование микродомена Ca2+ путем визуализации нестимулированных первичных мышей Orai1-/-, Stim1-/-, Stim2-/- и Ryr1-/- и сравнили их с первичными Т-клетками мыши WT. Анализ формирования микродомена Ca2+ охватывал скорость начала сигнала, амплитуду Ca2+ и количество сигналов в конфокальной плоскости. Примечательно, что за исключением Stim2-/- Т-клеток, все KO Т-клетки продемонстрировали значительное снижение локальных сигналовCa2+ и сниженную базальную концентрацию свободного цитозольногоCa2+ по сравнению с WT-клетками. Это привело нас к выводу, что образование микродоменов Ca2+ неразрывно связано с взаимодействием ORAI1, STIM1 и RyR14. Кроме того, мы успешно идентифицировали и охарактеризовали спонтанные микродомены Ca2+ на плазматической мембране. Эти микродомены Ca2+ характеризовались амплитудой Ca2+ 290 нм ± 12 нм. Использование цветового кодирования сигналов Ca2+ позволило визуализировать микродомены Ca2+ по всей клетке. Полученные результаты также свидетельствуют о быстром возникновении микродоменов Ca2+, видимом в течение миллисекунд, и о способности этого метода обнаруживать сигналы Ca2+ с длительностью в несколько миллисекунд4. Эти спонтанные микродомены Ca2+ были позже идентифицированы как адгезионно-зависимые микродомены Ca2+ (ADCM), зависящие не только от SOCE, но и действующие через сигнальный каскад10 FAK/PLC-γ/IP3 и вовлечение P2X49. Кроме того, этот метод был основополагающим в подтверждении двойных оксидаз 1 и 2 (DUOX1/2) в качестве ферментов21, продуцирующих NAADP, и HN1L/JPT222в качестве одного из недавно открытых NAADP-связывающих белков23.
На рисунке 2 показаны репрезентативные примеры микродоменов Ca2+ в первичных CD4+ Т-клетках при контакте с шариками WT, а также у мышей P2x4-/- и P2x7-/-. Клетки были загружены красителями Ca2+ Fluo-4 AM и Fura Red AM и визуализированы со скоростью сбора данных 25 мс (40 кадров/с). Чтобы имитировать образование синапсов Т-клеток, клетки стимулировали гранулами, покрытыми анти-CD3/анти-CD28. Исходное образование микродомена Ca2+ анализировали за 1 с до и до 15 с после контакта с шариком с помощью конвейера DARTS. При контакте с шариком в клетке WT наблюдалось быстрое образование микродоменов Ca2+ в первую секунду после стимуляции в месте контакта с шариком (рис. 2A). Эти микродомены Ca2+ далее расширялись по всей клетке в течение следующих 15 с после контакта с шариками. В отличие от WT-клеток, P2x4-/- и P2x7-/-клетки (рис. 2B) показали снижение образования микродоменаCa2+ при стимуляции шариками, а также для P2x4-/-a более низкий базальный уровень до контакта с шариками. Эти репрезентативные результаты согласуются с ранее опубликованными результатами Brock et al.9, указывающими на образование микродоменаCa2+ в клетках WT непосредственно после контакта с шариками в течение 15 с и ниже сигналов на кадр в клетках P2x4-/- и P2x7-/- . Кроме того, амплитуда в P2x4-/-клетках была значительно снижена, что еще больше установило роль пуринергической передачи сигналов в адгезионно-зависимых микродоменах Ca2+ .
Кроме того, этот метод также может быть использован для визуализации начальных микродоменов Ca2+ в первичных CD4+ Т-клетках человека (рис. 3). В соответствии с первичными мышиными Т-клетками, начальные микродомены Ca2+ вызываются в месте контакта с шариками. Тем не менее, общий ответ Ca2+ , по-видимому, происходит в другом временном масштабе по сравнению с мышиными CD4+ Т-клетками.
Анализ локальных сигналов Ca2+ вручную невозможен, так как он является достаточно трудоемким и субъективным для конкретного исследователя. Поэтому мы ранее разработали алгоритм в MATLAB Simulink с использованием его инструментов обработки изображений и оптимизации для постобработки13 для анализа локальных микродоменов Ca2+ .
Недавно мы разработали новый конвейер постобработки с открытым исходным кодом под названием DARTS для анализа микродомена Ca2+ в визуализации живых клеток с высоким разрешением с использованием программной платформы Python12. В этом случае можно выбрать различные алгоритмы деконволюции, в зависимости от предпочтений пользователя, выполнить нормализацию формы клетки для компенсации морфологических изменений формы клетки, а также определить специфические параметры микроскопа и измерения (например, масштаб, частоту кадров, измеренное время) (рис. 4).
После выбора параметров для анализа микродомена Ca2+ для каждого отдельного измерения открывается второе всплывающее окно для определения контакта с шариком (рис. 5). Чтобы определить контакт шва, пользователь может вручную прокрутить файл tiff с помощью ползунка и выбрать рамку контакта шва по отдельности. Контакт борта выбирается щелчком мыши на месте контакта борта (рисунок 5, контакт борта и борта обозначен желтым кольцом и стрелкой), а также выбором ячейки. Этот шаг необходимо повторить для каждой интересующей клетки. Наконец, применяется автоматическая постобработка изображений, а данные результатов обобщаются и сохраняются в электронной таблице.
Рисунок 1: Рабочий процесс подготовки слайдов к визуализации. (A) Добавьте и распределите BSA и PLL на предметном стекле с помощью второго стекла. (В,В) Чтобы построить камеру, приклейте резиновые уплотнительные кольца с помощью силиконовой смазки к предметному стеколу. Убедитесь, что все кольцо покрыто тонким слоем смазки, чтобы обеспечить надлежащую изоляцию камеры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Репрезентативные клетки Т-клеточных рецептор-зависимых микродоменов Ca2+ в первичной мышиной дикой клетке (WT) (A), P2x4-/- или P2x7-/-(B) CD4+ Т. CD4+ Т-клетки отрицательно выделяли и загружали Fluo-4 AM и Fura Red, как описано выше. Т-клетки анализировали с помощью конвейера DARTS, в результате чего изображения клеток были сопоставимы с ранее опубликованными результатами9. (A) WT первичная Т-клетка за 1 с до стимуляции гранулами, покрытыми анти-CD3/анти-CD28, и до 15 с после стимуляции (масштабная линейка 5 мкм), а также 3D поверхностный график увеличения от 0 с до 0,65 с в области контакта бусин (масштабная линейка 1 мкм). (B) Верхняя полоса: репрезентативная P2x4-/- первичная Т-клетка за 1 с до и до 15 с после стимуляции бусинами. Нижняя полоса: репрезентативная P2x7-/- первичная Т-клетка за 1 с до и до 15 с после стимуляции бусинами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3: Микродомены Ca2+ в репрезентативной первичной Т-клетке человека после стимуляции TCR. Первичные человеческие CD4+ Т-клетки были выделены из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) методом флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS) из охристых оболочек и загружены Fluo-4 AM и Fura Red, как описано выше. На рисунке показана первичная Т-клетка человека за 1 с до стимуляции гранулами, покрытыми анти-CD3-покрытием, и до 15 с после стимуляции (масштабная линейка 5 мкм), а также 3D поверхностный график увеличения от 6,25 с до 7,5 с в области контакта бусин (масштабная линейка 1 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4: Графический интерфейс пользователя (GUI) DARTS. Графический интерфейс пользователя разделен на четыре области. В области ввода/вывода необходимо предоставить информацию о исходных данных, включая исходный каталог и конфигурацию изображения (два канала на файл или отдельные каналы), а также каталог результатов. В области Свойства измерения эксперимент должен быть описан со всей необходимой информацией, такой как масштаб (микроны на пиксель), частота кадров и интервал измерения относительно позже определенной начальной точки. Затем может быть собран конвейер обработки, состоящий из этапов постобработки, нормализации формы и фактического анализа (обнаружение микродоменов и накопление данных дартса). Наконец, настройки можно сохранить или загрузить с компьютера. После того, как анализ будет настроен, нажмите « Старт », чтобы продолжить. Чтобы узнать больше о настройке, посетите https://ipmi-icns-uke.github.io/DARTS/General/Usage.html. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5: Ручное определение бортовых контактов. Если шарики добавляются в клетки во время эксперимента, время первоначального контакта шарика с интересующей клеткой и место контакта должны быть определены вручную. Это делается путем прокрутки кадров с помощью ползунка и нахождения положения (x,y) в момент времени t. Чтобы автоматически заполнить поле контактной информации борта, пользователь нажимает на левую половину изображения микроскопа в месте контакта борта. Затем, чтобы связать ячейку с контактом шарика, пользователь щелкает по позиции внутри ячейки, которая имеет контакт с шариком. Информация должна быть подтверждена нажатием кнопки ДОБАВИТЬ ВАЛИК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Мы описали обширный протокол визуализации в живых клетках с высоким разрешением локальных микродоменов Ca2+ в первичных Т-клетках мыши и человека, вызванных стимуляцией TCR/CD3 с помощью гранул, покрытых антителами. Кроме того, мы реализовали удобный алгоритм на основе Python с открытым исходным кодом для идентификации и анализа локальных сигналов Ca2+. Следует отметить, что протокол не ограничивается обнаружением микродоменов Ca2+ в контексте стимуляции TCR/CD3, но может быть адаптирован к другим (иммунным) типам клеток, таким как NK-клеточные линии (KHYG-1)12 или TCR-независимые микродомены Ca2+ 10,11.
Важным шагом в рамках протокола является размер и количество стимулирующих шариков. Чтобы имитировать иммунный синапс, шарики должны быть похожи по размеру на клетки. Следовательно, для первичных мышиных и человеческих Т-клеток, а также клеточных линий (Jurkat и KHYG1) мы используем магнитные шарики диаметром 10 мкм. Кроме того, каждая клетка должна стимулироваться только одной бусиной. Поэтому количество бусин, добавляемых на каждый слайд, должно быть достаточным с одной стороны, но если бусин в поле зрения слишком много, фон увеличивается, и обнаружить ни одну точку времени активации и сторону контакта не представляется возможным.
В протоколе используются флуоресцентные красители Ca2+ Fluo-4 AM и FuraRed AM ратиометрическим образом, что позволяет калибровать данные13. Кроме того, протокол может быть адаптирован к другим индикаторным парам Ca2+ , но необходимо соблюдать осторожность в процессе выбора с точки зрения кинетики связывания Ca2+ , субклеточного распределения и фотообесцвечивания1. Кроме того, условия нагрузки должны быть разработаны и оптимизированы для каждого отдельного типа клеток, но указанные здесь концентрации являются хорошей отправной точкой. Для визуализации микродоменов Ca2+ Kd красителей Ca2+ должен находиться в диапазоне 300-1200 нМ, а время захвата за кадр должно составлять ≤60 мс. Если интенсивность флуоресценции слишком низкая, необходимо проверить набор фильтров, но также можно загрузить двойное количество красителя Ca2+ в Т-клетки. Тем не менее, краситель Ca2+ может перемещаться в другие органеллы или секвестироваться в везикулы, но он также может действовать как буфер Ca2+ и влиять на реакции Ca2+ .
Одним из ограничений алгоритма анализа является то, что предполагается сферическая форма ячейки; Следовательно, типы клеток с различной морфологией могут нуждаться в адаптации набора инструментов анализа. Алгоритм был использован для анализа локальных микродоменов Ca2+ в первичных мышиных Т-клетках, а также Т-клетках Jurkat и NK-клеточной линии (KHYG-1)12 и был успешно проведен при анализе микродоменов Ca2+ для нейрональной клеточной линии мыши (N2a, неопубликованные данные). В принципе, набор инструментов для протокола и анализа может быть использован для анализа несферических типов клеток, таких как клетки HEK293 или HeLa, но для этих типов клеток проекция дартс не может быть адаптирована, поскольку она основана на нормализации круглой структуры и формы клеток. Кроме того, протокол для обнаружения локализованных начальных микродоменов Ca2+ при стимуляции шариками может быть адаптирован для анализа локальных сигналов Ca2+, полученных от других стимулов, таких как растворимые активирующие или ингибирующие соединения, а также адгезионно-зависимые и TCR/CD3 независимые от Ca2+ микродомены10,11. Следует отметить, что легче определить контакт одного шарика с точки зрения времени и места, чем определить начальную точку активации после растворимых соединений.
Общим ограничением для обнаружения образования микродомена Ca2+ является требуемое высокое временно-пространственное разрешение и необходимое высокое отношение сигнал/шум (SNR). В настоящее время разрешение, полученное из нашей конфигурации, достигает расчетного пространственного разрешения ~0,368 мкм и временного разрешения ~40 кадров в секунду (кадров в секунду)1. Последние достижения в развитии камер и детекторов, а также усовершенствование флуоресцентных красителей могут привести к возможности достижения оптических одноканальных записей в том виде, в каком они были описаны для конструкций ORAI-GECI (генетически выраженные показатели Ca2+) для визуализации живых клеток с использованием показателей Ca2+ с более высоким временным и пространственным разрешением в будущем.
В совокупности описанные здесь протокол и аналитический инструмент для визуализации микродоменов Ca2+ с высоким разрешением могут быть использованы не только для анализа исходных локальных сигналов Ca2+ в Т-клетках, но также могут быть адаптированы к другим типам клеток для расшифровки значимости локальной передачи сигналов Ca2+ в них.
Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые можно было бы считать потенциальным конфликтом интересов.
Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (проект No 335447717; SFB1328, A02 до B-PD и RW; A14 до ET; номер проекта 516286863 в B-PD). Авторы благодарят доноров крови и отделение трансфузионной медицины УКЭ за сотрудничество.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
α-CD3 | BD Pharmingen | 553058 | |
α-CD28 | BD Pharmingen | 553295 | |
Anaconda | Anaconda | https://docs.anaconda.com/free/anaconda/install/index.html | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
Cell strainer | Biofil | CSS-013-070 | 70 µm diameter |
Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | A49865 | |
Cover slips | Paul Marienfeld GmbH | 101202 | |
DARTS | GitHub | https://github.com/IPMI-ICNS-UKE/DARTS | |
Dulbecco’s Phosphate buffered saline | Gibco, Thermo Fisher | 14190144 | |
EasySep CD4+ T cell Isolation Kit | Stemcell | 19852 | |
EasySep Magnetic Multistand | Stemcell | 18010 | |
Fluo 4-AM | Invitrogen | F14201 | |
Fura Red-AM | Invitrogen | F3020 | |
Gibco RPMI 1640 medium | Gibco, Thermo Fisher | 11875093 | |
Git | GitHub | https://git-scm.com/book/en/v2/Getting-Started-Installing-Git | |
immersion oil | Leica | 11513859 | |
Newborn calf serum | Sigma-Aldrich | N4637 | |
Oracle | Oracle | https://www.oracle.com/de/java/technologies/downloads/ | |
Penicillin/Streptamycin | Gibco, Thermo Fisher | 15240062 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
Protein G magnetic beads | Merck | LSKMAGG02 | 10 µM diameter |
Python | Python | https://www.python.org/downloads/ | |
Silicon grease (basylone) | Bayer | 291-1220 | |
Time-Dependent Entropy Deconvolution | GitHub | https://ipmi-icns-uke.github.io/TDEntropyDeconvolution/General/2-usage.html#input-parameters | |
Tween | q-biogene | TWEEN201 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены