Для начала получите человеческую микроглию из человеческих эмбриональных стволовых клеток и соберите их на 56-й день. Для получения органоидов сетчатки культивируйте эмбриональные стволовые клетки человека в среде стволовых клеток до тех пор, пока плотность клеток не достигнет 80-90%. Добавьте по одному миллилитру на лунку к культуральным клеткам и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. После удаления диспа добавьте по одному миллилитру среднего D в каждую лунку.
Нарежьте ячейки небольшими кусочками. С помощью пипетки объемом 10 микролитров аккуратно соберите все кусочки клеток и среду в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Центрифугируйте пробирку при плотности 200 х г в течение пяти минут.
После удаления надосадочной жидкости аккуратно ресуспендируйте клетки в 200 микролитрах холодной матрицы. Переместите пробирку микроцентрифуги объемом 1,5 миллилитра в инкубатор на 20 минут. Через 20 минут в инкубаторе матрица застынет.
Приготовьте 10-сантиметровую посуду с 15 миллилитрами среднего D. Суспендируйте матрицу со средним D. Слегка встряхните чашку Петри. Поместите блюдо в инкубатор на пять дней. На 12 день замените средство на три миллилитра диспа.
Через пять минут отсадите жидкость и добавьте 15 миллилитров среды Е. Введите собранную микроглию в переваренные органоиды сетчатки на 12 день. На 19-й день осторожно поверните тарелку, чтобы агрегировать органоиды к центру чашки, и замените среду E на среду F. Наконец, перенесите органоиды со средой F в новую суспензию. К 30-му дню органоиды сетчатки, совместно культивируемые с микроглией, показали значительную аутофлуоресценцию GFP, что указывает на наличие микроглии.
Совместно культивируемые органоиды сетчатки демонстрировали четкие иммунофлуоресцентные сигналы для фоторецепторного маркера CRX и микроглиального маркера IBA1.
