Cette méthode peut être utilisée pour la dissection du pancréas porcin contenant des lobes de connexion, duodénaux et spléniques et la décellularisation éventuelle par la perfusion de détergents à des températures froides. Bien que cette méthode de décellularisation donne un aperçu du pancréas porcin, elle peut également être appliquée au pancréas d’autres grands animaux. Le principal avantage de cette technique est qu’elle facilite la récupération intacte d’un organe compliqué, comme le pancréas, pour d’autres applications d’ingénierie tissulaire.
Généralement, les individus nouveaux à cette méthode, ils lutteront parce que la dissection du pancréas intact tout en identifiant et en ligating tous les vaisseaux sanguins environnants exige beaucoup de pratique pour maîtriser. Avant de commencer la procédure, utilisez un tube de silicone de trois par cinq millimètres pour connecter le récipient de détergent à la pompe périssaltique et un deuxième tube de silicone de trois par cinq millimètres pour connecter la pompe périistaltique à la chambre d’organe par l’intermédiaire du dégasser. Connectez un Luer mâle à l’extrémité libre du deuxième tube, et utilisez un troisième tube de silicone de trois par cinq millimètres pour connecter la chambre d’organe au récipient de collecte de détergent par l’intermédiaire de la pompe péristaltique.
Enfin, connectez une pipette non étiquetée de deux millimètres aux extrémités libres des tubes dans le récipient de détergent et le récipient de collecte de détergent. Ensuite, placez la configuration de décellularisation à quatre degrés Celsius. Pour récolter le pancréas, placez un porc femelle héparinisé de 45 kilogrammes sur une table de dissection en position de supination, et utilisez un scalpel pour faire une incision médiane de 40 centimètres du processus xiphoïde à l’os pubien pour exposer les organes abdominaux.
Après avoir identifié les lobes spléniques, duodénaux et de connexion, localisez la papille duodénale majeure et utilisez deux sutures individuelles pour ligate oralement le duodénum du site. Ligate l’œsophage inférieur avec sutures supplémentaires, et couper entre les ligatures avec des ciseaux pour faciliter l’ablation de l’estomac. Séparez les tissus conjonctifs du côlon pour atteindre l’intestin grêle, et séparez le tissu conjonctif du côlon qui se fixe au lobe splénique du pancréas.
Les intestins grêles sont fixés au pancréas par tissu conjonctif au lobe splénique, mais entourent également le pancréas. Vous devez suivre attentivement le chemin intestinal pour démêler et séparer le tissu conjonctif entre l’intestin et le pancréas. Après avoir ligating les artères, enlever le côlon de l’intestin grêle.
Identifiez la veine mesenteric inférieure, l’arbre mésentérique inférieur d’artère, et ligate les vaisseaux avec un caudal de suture au pancréas et coupé avec des ciseaux. Ligate l’artère et la veine spléniques ensemble dans le hilum, près de la rate, et couper distally avec des ciseaux pour enlever la rate. Suivez le duodène jusqu’à ce que les lobes duodénaux et de connexion soient dégagés, et ligate le duodène à la fin avec deux sutures séparées.
La partie du duodène qui est en contact étroit avec la connexion et les lobes duodénaux est enlevée avec le pancréas, car la ligature de tous les petits vaisseaux sanguins entre les deux organes est trop difficile. Après avoir disséqué la veine portail, ligate le vaisseau avec une suture pour prévenir toute fuite de sang du foie, et disséquer et ligate le canal biliaire et l’artère hépatique avec deux sutures. Puis, couper la veine portail, l’artère hépatique, et le canal biliaire avec des ciseaux.
Localiser l’aorte sous la veine rénale, et disséquer l’aorte dans la direction crânienne du muscle et du tissu conjonctif jusqu’à ce que le vaisseau atteigne le pancréas. Maintenant, retournez doucement le pancréas, et disséquez l’aorte, gardant l’artère mésentérique supérieure et le tronc coeliaque intacts. Couper l’aorte crânienne au tronc coeliaque, et émousser disséquer le tissu environnant restant pour permettre la récolte du pancréas.
Ensuite, utilisez une seringue de 50 millilitres reliée à une canule d’artériotomie de quatre millimètres pour rincer l’organe à travers l’aorte avec la solution deux jusqu’à ce que l’organe entier soit perfusé ou jusqu’à ce que tout l’organe refroidisse. Placez la solution deux pancréas perfusé sur un plateau métallique sur la glace, avec de l’aorte face vers le haut, et utilisez des ciseaux pour couper les sutures du dudénodum. Utilisez une pipette de 25 millilitres pour rincer le dudénodum avec 50 à 150 millilitres d’eau ultrapure, et religatez le tissu avec des sutures fraîches.
Ligate une extrémité de l’aorte et toutes les branches, à l’exclusion de l’artère mésenterique supérieure et le tronc coeliaque, pour prévenir les fuites, et insérer une canule artériotomie de quatre millimètres dans l’autre extrémité de l’aorte. Ensuite, placez le pancréas dans la chambre d’organe, et connectez la canule dans le pancréas à un mâle Luer. Ensuite, infuser le pancréas avec la solution trois pendant une heure à 20 millilitres par minute, et congeler le pancréas à double perfusé à moins 20 degrés Celsius dans la solution quatre jusqu’au début de la décellularisation.
Le jour du début de la décellularisation, décongeler le pancréas à quatre degrés Celsius et placer le pancréas décongelé dans la chambre de l’organe de décellularisation. Connectez le tube d’entrée de détergent à l’aorte du pancréas, et lavez le pancréas avec la solution trois à 20 millilitres par minute pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, décanter toute solution restant dans la chambre d’organe, et perfuser le pancréas pendant 30 minutes à 20 millilitres par minute dans la solution cinq à quatre degrés Celsius.
À la fin de la solution cinq perfusion, parcourir le pancréas pendant huit heures à 20 millilitres par minute dans la solution six et quatre degrés Celsius, suivie d’un lavage de 96 heures dans la solution fraîche cinq à 20 millilitres par minute et quatre degrés Celsius. Remplacez le lavage par 500 millilitres de DPBS complétés par du calcium et du magnésium pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius, suivis de la perfusion avec 250 millilitres de solution sept pendant quatre heures à 20 millilitres par minute et 37 degrés Celsius. Ensuite, lavez l’organe encore 120 heures avec la solution fraîche cinq à 20 millilitres par minute et quatre degrés Celsius, et stockez l’organe dans la solution huit.
Ici, la morphologie brute d’un pancréas normal, qui apparaît rose clair et contient des lobes spléniques, de connexion et duodénales, peut être observée. Après la décellularisation, la couleur rose est perdue, et le pancréas traité apparaît de couleur blanche pâle. Dans un pancréas normal, de nombreux noyaux bleus sont apparents par la coloration H et E, tandis que dans un pancréas décellulaire les noyaux ne peuvent plus être visualisés, confirmant leur perte.
Le pancréas porcin intact isolé, suivant cette procédure, il permettra une perfusion complète et une décellularisation réussie tout en préservant la structure et en permettant également l’obtention de certaines protéines matricielles extracellulaires. Le pancréas décellulaire peut être utilisé pour développer des stratégies de recellularisation des organes entiers dans les systèmes bioréacteurs avec des types de cellules pertinents. Après la recellularisation avec les cellules souches bénéficiaires, le pancréas conçu par les tissus peut être utilisé pour des applications cliniques et des tests de dépistage de médicaments.
N’oubliez pas que travailler avec Triton X-100 et DDC peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port de gants et la préparation des solutions sous le capot des fumées, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
