この方法は、接続、十二指腸、脾臓葉を含むブタ膵臓の解剖および低温時の洗剤の灌流による最終的な脱細胞化に使用することができる。この脱細胞化法は、ブタ膵臓に関する洞察を提供するが、他の大型動物の膵臓にも適用される可能性がある。この技術の主な利点は、さらに組織工学的な適用のために、膵臓のような複雑な器官の無傷の検索を容易にすることである。
一般的に、この方法に新しい個人は、周囲のすべての血管を識別し、連結しながら、無傷の膵臓の解剖が習得するために多くの練習を必要とするので、彼らは苦労します。手順を開始する前に、1つの3〜5ミリメートルのシリコーンチューブを使用して、洗浄剤容器を蠕動ポンプに接続し、2番目の3〜5ミリメートルのシリコーンチューブを使用して、蠕動ポンプを脱ガッサーを介して臓器室に接続します。オスのLuerを2本目のチューブの自由端に接続し、3つ1~5ミリメートルのシリコンチューブを使用して、蠕動ポンプを介して臓器室を洗剤回収容器に接続します。
最後に、2ミリメートルのラベルなしピペットを、洗剤容器と洗剤回収容器のチューブの自由端に接続します。次に、脱細胞化の設定を摂氏4度に設定します。膵臓を収穫するには、ヘパリン化された45キログラムの雌豚をスピーニン位置の解剖台に置き、メスを使ってxiphoidプロセスから陰部骨への40センチメートルの中線切開を行い、腹部器官を露出させる。
脾臓、十二指腸、および接続ローブを同定した後、主要な十二指腸乳頭を見つけ、2つの個々の縫合糸を使用して、サイトから十二指腸を経口的にリゲートする。下の食道を追加の縫合糸でリゲートし、合字の間をはさみで切り取り、胃の除去を容易にする。結腸組織を結腸から分離して小腸に到達し、膵臓の脾臓に付着する結腸の結合組織を分離する。
小腸は脾臓の葉で結合組織によって膵臓に付着するが、また膵臓を取り囲む。腸と膵臓の間の結合組織を解きほぐし、分離するために腸の経路に注意深く従う必要があります。動脈を結紮した後、小腸から結腸を取り除く。
下腸間膜静脈、下腸間膜動脈の木を識別し、膵臓に1つの縫合口尾で血管をリゲートし、はさみで切断します。脾動脈と静脈をヒラムで一緒にリゲートし、脾臓に近づき、はさみで遠分切って脾臓を取り除きます。十二指腸と接続ローブがクリアされるまで十二指腸に従い、最後に十二指腸を2つの別々の縫合糸でリゲートします。
2つの器官間のすべての小さな血管の結紮が困難すぎるため、接続と十二指腸葉と密接に接触している十二指腸の部分は、膵臓と除去される。門脈を解剖した後、肝臓からの血液漏れを防ぐために1つの縫合糸で血管をリゲートし、胆管と肝動脈を2つの縫合糸で解剖し、リゲートする。その後、門脈、肝動脈、胆管をはさみで切ります。
腎静脈の下で大動脈を見つけ、血管が膵臓に到達するまで筋肉および結合組織から頭蓋方向に大動脈を解剖する。さて、膵臓をそっとひっくり返し、大動脈を解剖し、上の腸間膜動脈とセリアックトランクをそのまま維持します。大動脈頭蓋をセリアックトランクに切り、残りの周囲の組織を鈍く解剖して膵臓の収穫を可能にする。
次に、4ミリの動脈切開カニューレに接続された50ミリリットルの注射器を使用して、臓器全体が浸透するまで、または臓器全体が冷たくなるまで、大動脈を通して大動脈を通して大動脈を洗い流す。溶液2つの浸透した膵臓を氷の上の金属トレイに置き、大腸を上に向け、はさみを使用して十二指腸から縫合糸を切断します。25ミリリットルのピペットを使用して、十二指腸を50〜150ミリリットルの超純水で洗い流し、新鮮な縫合糸で組織を再縫いします。
大動脈の一方の端と、上の腸間膜動脈とセリアック幹を除くすべての枝をリゲートして漏れを防ぎ、4ミリメートルの動脈開管を大動脈の反対側に挿入する。次に、膵臓を臓器室に入れ、膵臓のカニューレを男性のルエルに接続します。その後、1分間に20ミリリットルで1時間溶液3で膵臓を浸透させ、二重浸透した膵臓を解放菌開始まで溶液4でマイナス20度で凍結する。
脱細胞化を開始した日には、膵臓を摂氏4度で解凍し、解凍した膵臓を脱細胞化器官室に入れます。洗剤入口チューブを膵臓の大大小に接続し、1分間に20ミリリットルの溶液3で膵臓を摂氏4度で一晩洗います。翌朝、臓器室に残っている溶液をデカントし、4°Cの溶液5で毎分20ミリリットルで膵臓を30分間浸透させた。
溶液5回の灌流の終わりに、溶液6と4°Cで毎分20ミリリットルで8時間膵臓を浸透させ、続いて新鮮な溶液5で96時間の洗浄を毎分20ミリリットル、摂氏4度で洗浄する。洗浄をカルシウムとマグネシウムを30分間摂氏37度で30分間補ったDPBSの500ミリリットルに置き換え、続いて250ミリリットルの溶液を4時間、毎分20ミリリットル、摂氏37度で灌流します。その後、1分間に20ミリリットル、摂氏4度で新鮮な溶液5で臓器をさらに120時間洗浄し、オルガンを溶液8に保存します。
ここでは、薄いピンク色に見え、脾臓、接続、十二指葉を含む正常な膵臓の総形態が観察される。脱細胞化後、ピンク色が失われ、処理された膵臓は淡い白色に見えます。正常な膵臓では、多くの青色核はH染色とE染色によって明らかであり、脱細胞化された膵臓では核はもはや視覚化されず、その喪失を確認する。
単離されたインタクトブタ膵臓は、この手順に従って、構造を維持しながら完全な灌流と脱細胞化を可能にし、またいくつかの細胞外マトリックスタンパク質を得ることを可能にする。脱細胞化膵臓は、関連する細胞タイプのバイオリアクターシステムにおける全臓器の再細胞化戦略の開発に使用できます。レシピエント幹細胞による再細胞化後、組織設計膵臓は臨床応用および薬物検査に使用され得る。
Triton X-100およびSDCでの作業は非常に危険であり、手袋を着用したり、ヒュームフードの下でソリューションを準備するなど、予防措置は常にこの手順を実行している間に取られるべきであることを忘れないでください。
