Этот протокол описывает метод быстрого скрининга тысяч геномов с использованием сперматозоидов рыбок данио-рерио с помощью F0 CRISPR. Эта техника выгодна своей доступностью. Вместо дорогостоящих специализированных подходов, основанных на секвенировании, наш метод использует рестрикционные ферменты ПЦР и гель-электрофорез для скрининга носителей F0 мужского пола на наличие инделов или специфических изменений генома.
Самая сложная часть этой процедуры - просто быстро получить сперму, но она становится хорошей техникой для экстракорпорального оплодотворения, если мы работаем с большим количеством дисморфических рыб, и поэтому для нас это простой способ скрещивать рыб, которые доставляют нам проблемы. Начните с установки резервуаров для разведения как для дикого типа, так и для рыб F0 и инкубируйте резервуары в течение ночи. После обезболивания самца рыбы на следующий день шумовкой переложите его на стопку чистых бумажных полотенец.
Аккуратно обкатайте рыбу, чтобы убрать лишнюю воду. Удалите воду, промокнув ее насухо чистой сложенной тканью. Шумовкой переложите рыбу на подготовленную губку.
Положите рыбу брюшной стороной вверх и аккуратно промокните область вокруг анальных плавников чистой сложенной папиросной бумагой. Чтобы собрать сперму, используйте капиллярную трубку, чтобы аккуратно отодвинуть брюшные плавники от средней линии, обнажив клоаку. Поместите капиллярную трубку рядом с клоакой.
Пальцами или щипцами фильтра аккуратно сожмите бока рыбы от жабр вниз. Используя капиллярное действие, соберите сперму в пробирку и поместите ее в пробирку для ПЦР, содержащую 40 микролитров 50-миллимолярного раствора гидроксида натрия, затем вытесните образец в пробирку. После вращения образцов спермы в мини-центрифуге поместите пробирки для ПЦР в термоциклер.
Запустите циклер, нагревая образцы в течение 40 минут при 95 градусах Цельсия с последующим охлаждением при 25 градусах Цельсия. После извлечения образцов из циклера нейтрализуйте рН, добавив 10 микролитров одного молярного триса гидрохлорида рН восемь. Смешайте путем аспирации суспензии, а затем центрифугируйте образцы.
Установите термоциклер на 95 градусов Цельсия для предварительного нагрева. А тем временем подготовьте 25 микролитров реакционной смеси ПЦР для каждого образца спермы. Хорошо перемешайте, пипеткой вверх и вниз, затем открутите образцы.
Поместите образцы в предварительно нагретый термоциклер и установите цикл. Чтобы получить раствор геля, разогрейте в микроволновой печи 4%-ный раствор агарозного геля, приготовленный путем смешивания порошка агарозы, гелевого пятна и буфера КЭ. Налейте гелевый раствор в рамку для литья геля и вставьте расческу с одной стороны.
После застывания геля аккуратно снимите расческу. Поместите гель в установку для электрофореза так, чтобы лунки были ближе всего к отрицательному электроду. Залейте проточный буфер TBE в буровую установку до тех пор, пока скважины не будут полностью погружены в воду.
Начните загружать гель с пипетки пять микролитров лестницы ДНК в первую лунку. Загрузите оставшиеся лунки от 5 до 10 микролитров продукта ПЦР. Запустите гель в течение 1 часа при напряжении 150 вольт, чтобы обеспечить адекватное разделение ампликонов.
Используйте гелевый тепловизор для просмотра полос ДНК. Анализ локуса p2ry12 показал, что ампликон дикого типа отображал одну полосу длиной 250 пар оснований, в то время как ампликоны мужского пола, введенные F0, содержащие инделы, работали как несколько полос. Анализ локуса ДНК10 показал, что ампликон дикого типа работает как одна длинная полоса из 400 пар оснований.
Мужские ампликоны, содержащие инделы, вводимые F0, работали в виде нескольких полос или в виде одной полосы с уменьшенной подвижностью геля. Мужчина номер один, введенный в F0, имел дополнительную полосу в переваренном продукте, которая отсутствовала в продукте ПЦР, что делало его лучшим кандидатом-основателем для создания мутантной линии нокаута. Если самец рыбы не производит сперму при сжатии, лучше всего дать рыбе отдохнуть в течение недели и попробовать еще раз, вместо того, чтобы сжимать их слишком сильно и рисковать причинить им вред.
После того, как FC или основатель мужского пола скрещивается, аллели должны быть проверены в последовательности потомства F1. Прямое секвенирование ампликонов F1 и выполнение анализа гетерозиготных аллелей — простой способ сделать это.
