Этот протокол представляет собой асептическую технику для использования с C.Elegans, которая устраняет необходимость в открытом пламени. Основными преимуществами данной методики является то, что она снижает угрозу безопасности за счет устранения открытого пламени и может использоваться в лабораторных помещениях без газовых магистралей и в ламинарных проточных вытяжках. Перемещение инструментов в зону стерилизации и из нее, не касаясь сторон, может быть затруднено, но добавление направляющей и стабилизация руки облегчает движение.
Начните с прикрепления направляющей аксессуара держателя петли к микроуборочному заводу, прикрепив его к внешнему стволу. Подключите микросинератор к стандартной электрической розетке напряжением 120 или 230 В, если это необходимо. Поверните микроинсинератор на высокий уровень и дайте ему прогреться в течение 10-20 минут, чтобы достичь оптимальной температуры от 800 до 825 градусов по Цельсию.
Вставьте инструмент в цилиндрическую зону стерилизации, не касаясь боковых сторон, сдвинув его по направляющей. Держите инструмент в зоне стерилизации в течение пяти-семи секунд. Извлеките инструмент, не касаясь боковых сторон, скользя назад вдоль направляющей.
Для отмычек дайте инструменту остыть в течение трех-пяти секунд, прежде чем коснуться червя, чтобы избежать его сжигания. После сбора червей снова вставьте кирку в камеру на пять-семь секунд, чтобы сжечь червей на кирке. Подключите горелку Бунзена к газовой магистрали с помощью резиновых трубок.
Убедитесь, что трубка плотно закреплена и расположена горелка подальше от надземных предметов. Включите газ, повернув ручку на газопроводе. Воспламените горелку с помощью ударника или зажигалки.
Отрегулируйте пламя с помощью газовой ручки и воздухозаборника, пока не будет виден синий конус. Держите кирку, шпатель или скальпель в пламени, пока он не загорится красным. Для отмычек дайте инструменту остыть в течение трех-пяти секунд, прежде чем коснуться червя, чтобы избежать его сжигания.
После сбора червей снова вставьте кирку в пламя, чтобы испепелить любых червей на кирке. Культивируйте бактерии OP50 E.coli в бульоне Luria на ночь на шейкере с температурой 37 градусов цельсия. После ночной культуры разводят культуру в стерильной воде в соотношении 1:100.
Окуните червячную кирку, стерилизованную с помощью горелки Бунзена или микросинератора, в бактериальный раствор, повторно стерилизуйте и закрутите ее в 100 микролитрах стерильной воды. Для положительного контроля окуните кирку в бактериальный раствор, закрутите в стерильной воде, а для отрицательного контроля стерилизуйте кирку, не погружая в бактериальный раствор, а затем закрутите в стерильную воду. Нанесите 100 микролитров воды на 10-сантиметровую чашку Петри из бульона Лурия, распределите воду с помощью стерильного разбрасывателя клеток и высиживайте при комнатной температуре в течение 24 часов с крышкой.
Подсчитывайте колонии вручную после инкубационного периода. Относительную степень загрязнения измеряли путем подсчета количества колоний на образец. В отрицательных контрольных пластинах были обнаружены нулевые колонии.
Среднее количество 4,7 колоний со стандартной погрешностью 0,3 колонии было получено, когда горелка Бунзена использовалась для стерилизации кирк. Среднее количество 3,3 колоний со стандартной погрешностью 1,2 колонии наблюдалось в условиях микросинератора. Однако среднее количество 298,3 колоний было получено в положительном контрольном состоянии.
Таким образом, микроинсинератор достиг результатов стерильности, одинаково эффективных для горелки Бунзена. После этой процедуры могут быть выполнены любые методы, которые включают в себя сбор или дробление C.Elegans. Таким образом, он применим к широкому кругу исследовательских вопросов.
