Este protocolo apresenta uma técnica asséptica para uso com C.Elegans que elimina a necessidade de uma chama aberta. As principais vantagens desta técnica são que ela reduz os riscos de segurança eliminando uma chama aberta e pode ser usada em espaços de laboratório sem linhas de gás e em capô de fluxo laminar. Mover instrumentos para dentro e para fora da área de esterilização sem tocar nas laterais pode ser difícil, mas adicionar um guia e estabilizar a mão facilita o movimento.
Comece anexando um guia acessório de suporte de loop ao micro-incinerador, cortando-o no barril externo. Conecte o micro-incinerador a uma tomada elétrica padrão de 120 ou 230 volts, conforme apropriado. Gire o micro-incinerador para o ajuste Alto e deixe-o aquecer por 10 a 20 minutos para atingir uma temperatura ideal entre 800 e 825 graus Celsius.
Insira o instrumento na área de esterilização cilíndrica sem tocar nas laterais deslizando-o ao longo do guia. Segure o instrumento na área de esterilização por cinco a sete segundos. Remova o instrumento sem tocar nas laterais deslizando para trás ao longo do guia.
Para as escolhas, deixe o instrumento esfriar por três a cinco segundos antes de tocar em um verme para evitar queimá-lo. Depois de colher vermes, reinserir a picareta na câmara por cinco a sete segundos para incinerar qualquer verme na picareta. Conecte um queimador Bunsen à linha de gás usando tubos de borracha.
Certifique-se de fixar a tubulação firmemente e posicionar o queimador longe de objetos aéreos. Ligue o gás girando o botão na linha de gás. Aciime o queimador usando um atacante ou um isqueiro.
Ajuste a chama usando o botão de gás e a entrada de ar até que um cone azul esteja visível. Segure a picareta, espátula ou bisturi na chama até que ela brilhe vermelha. Para as escolhas, deixe o instrumento esfriar por três a cinco segundos antes de tocar em um verme para evitar queimá-lo.
Depois de colher vermes, reinserir a picareta na chama para incinerar qualquer verme na picareta. Cultura OP50 E.coli bactérias no caldo luria durante a noite em um shaker Celsius de 37 graus. Após a cultura da noite para o dia, diluir a cultura em água estéril a uma proporção de 1:100.
Mergulhe uma picareta de vermes esterilizada usando um queimador Bunsen ou um micro-incinerador na solução bacteriana, reestrucionar e rodopiá-lo em 100 microliters de água estéril. Para um controle positivo, mergulhe a picareta em solução bacteriana, gire em água estéril e, para o controle negativo, esterilize a picareta sem mergulhar em solução bacteriana e, em seguida, gire para a água estéril. Emcore os 100 microliters de água em uma placa de ágar ágar Petri de 10 centímetros, espalhe a água usando um espalhador de células estéreis e incubar à temperatura ambiente por 24 horas com a tampa ligada.
Conte as colônias manualmente após o período de incubação. A taxa de contaminação relativa foi medida pela contagem do número de colônias por amostra. Em placas de controle negativas, foram encontradas colônias zero.
Uma contagem média de 4,7 colônias com um erro padrão de 0,3 colônias foi obtida quando o queimador de Bunsen foi usado para esterilizar picaretas. Observou-se uma contagem média de 3,3 colônias com erro padrão de 1,2 colônias na condição de micro-incinerador. No entanto, obteve-se uma contagem média de 298,3 colônias na condição de controle positivo.
Assim, o micro-incinerador alcançou resultados de esterilidade igualmente eficazes para o queimador Bunsen. Após este procedimento, quaisquer métodos que envolvam a colheita ou angção de C.Elegans podem ser realizados. Assim, é aplicável a uma grande variedade de questões de pesquisa.
