Questo protocollo presenta una tecnica asettica per l'uso con C.Elegans che elimina la necessità di una fiamma aperta. I principali vantaggi di questa tecnica sono che riduce i rischi per la sicurezza eliminando una fiamma aperta e può essere utilizzata in spazi di laboratorio senza linee di gas e in cappe a flusso laminare. Spostare gli strumenti dentro e fuori dall'area di sterilizzazione senza toccare i lati può essere difficile, ma l'aggiunta di una guida e la stabilizzazione della mano facilitano il movimento.
Iniziare collegando una guida accessoria per il supporto del loop al micro-inceneritore agganciandola alla canna esterna. Collegare il microinceneritore a una presa elettrica standard da 120 o 230 volt, a seconda dei casi. Ruotare il microinceneritore sull'impostazione Alta e lasciarlo riscaldare per 10-20 minuti per raggiungere una temperatura ottimale tra 800 e 825 gradi Celsius.
Inserire lo strumento nell'area di sterilizzazione cilindrica senza toccare i lati facendolo scorrere lungo la guida. Tenere lo strumento nell'area di sterilizzazione per cinque-sette secondi. Rimuovere lo strumento senza toccare i lati facendo scorrere all'indietro lungo la guida.
Per i plettri, lasciare raffreddare lo strumento per tre o cinque secondi prima di toccare un verme per evitare di bruciarlo. Dopo aver raccolto i vermi, reinserire il piccone nella camera per cinque-sette secondi per incenerire eventuali vermi sul piccone. Collegare un bruciatore Bunsen alla linea del gas utilizzando tubi di gomma.
Assicurarsi di fissare saldamente il tubo e posizionare il bruciatore lontano da oggetti aerei. Accendere il gas ruotando la manopola sulla linea del gas. Accendere il bruciatore usando un percussore o un accendino.
Regolare la fiamma utilizzando la manopola del gas e la presa d'aria fino a quando non è visibile un cono blu. Tieni il plettro, la spatola o il bisturi nella fiamma fino a quando non si illumina di rosso. Per i plettri, lasciare raffreddare lo strumento per tre o cinque secondi prima di toccare un verme per evitare di bruciarlo.
Dopo aver raccolto i vermi, reinserire il piccone nella fiamma per incenerire eventuali vermi sul piccone. Coltura di batteri OP50 E.coli in brodo di Luria durante la notte su uno shaker a 37 gradi Celsius. Dopo la coltura durante la notte, diluire la coltura in acqua sterile in un rapporto di 1:100.
Immergere un worm pick sterilizzato con un bruciatore Bunsen o un micro-inceneritore nella soluzione batterica, ri-sterilizzare e ruotarlo in 100 microlitri di acqua sterile. Per il controllo positivo, immergere il plettro in soluzione batterica, ruotare in acqua sterile e, per il controllo negativo, sterilizzare il plettro senza immergerlo in soluzione batterica e quindi ruotare nell'acqua sterile. Placcare i 100 microlitri d'acqua su una capsula di Petri di agar brodo Luria da 10 centimetri, distribuire l'acqua usando uno spandicellulare sterile e incubare a temperatura ambiente per 24 ore con il coperchio acceso.
Contare le colonie manualmente dopo il periodo di incubazione. Il tasso di contaminazione relativo è stato misurato contando il numero di colonie per campione. Nelle piastre di controllo negative sono state trovate zero colonie.
Un conteggio medio di 4,7 colonie con un errore standard di 0,3 colonie è stato ottenuto quando il bruciatore Bunsen è stato utilizzato per sterilizzare i picconi. Un conteggio medio di 3,3 colonie con un errore standard di 1,2 colonie è stato osservato nella condizione di micro-inceneritore. Tuttavia, un conteggio medio di 298,3 colonie è stato ottenuto nella condizione di controllo positivo.
Pertanto, il micro-inceneritore ha ottenuto risultati di sterilità ugualmente efficaci per il bruciatore Bunsen. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire tutti i metodi che comportano la raccolta o la spezzettamento di C.Elegans. Pertanto, è applicabile a un'ampia varietà di domande di ricerca.
