このプロトコルは、裸火の必要性を排除するC.Elegansで使用するための無菌技術を提示する。この技術の主な利点は、直火を排除することによって安全上の危険を軽減し、ガスラインのない実験室空間や層流フードで使用できることです。側面に触れずに器具を滅菌エリアに出し入れするのは難しいかもしれませんが、ガイドを追加して手を安定させると動きが簡単になります。
まず、ループホルダーアクセサリガイドを外側のバレルにクリップしてマイクロ焼却炉に取り付けます。必要に応じて、マイクロ焼却炉を標準の120ボルトまたは230ボルトのコンセントに差し込みます。マイクロ焼却炉を「高」設定にし、10 ~ 20 分間ウォームアップして、摂氏 800 ~ 825 度の最適温度に達します。
ガイドに沿ってスライドさせて、側面に触れることなく円筒形の滅菌領域に器具を挿入します。器具を滅菌エリアに5~7秒間保持します。ガイドに沿って後方にスライドさせて、側面に触れずに楽器を取り外します。
ピックの場合は、ワームを燃やさないようにワームに触れる前に、楽器を3〜5秒間冷やします。ワームをピッキングした後、ピックをチャンバーに5〜7秒間挿入し直して、ピック上のワームを焼却します。ゴムチューブを使用して、ブンゼンバーナーをガスラインに接続します。
チューブをしっかりと固定し、バーナーを頭上の物体から遠ざけてください。ガスラインのつまみを回してガスを入れます。ストライカーまたはライターを使用してバーナーに点火します。
青い円錐形が見えるまで、ガスノブと吸気口を使用して炎を調整します。ピック、ヘラ、またはメスを赤く光るまで炎の中に入れます。ピックの場合は、ワームを燃やさないようにワームに触れる前に、楽器を3〜5秒間冷やします。
ワームをピッキングした後、ピックを炎の中に挿入し直して、ピック上のワームを焼却します。ルリアブロス中のOP50大腸菌を摂氏37度のシェーカーで一晩培養する。一晩培養した後、培養物を滅菌水で1:100の割合で希釈する。
ブンゼンバーナーまたはマイクロ焼却炉で滅菌したワームピックを菌液に浸し、再滅菌し、100マイクロリットルの滅菌水で渦巻く。陽性対照の場合は、ピックを菌液に浸し、滅菌水に旋回させ、陰性対照の場合は、菌液に浸さずにピックを殺菌してから、滅菌水に旋回させる。100マイクロリットルの水を10センチメートルのルリアブロス寒天シャーレにプレートし、滅菌細胞スプレッダーを用いて水を広げ、蓋をして室温で24時間インキュベートした。
潜伏期間後にコロニーを手動でカウントする。相対汚染率は、試料あたりのコロニー数をカウントすることにより測定した。陰性対照プレートでは、ゼロコロニーが見出された。
4.7コロニーの平均数と標準誤差0.3コロニーは、ブンゼンバーナーを使用してピックを滅菌したときに得られました。マイクロ焼却炉条件では、標準誤差1.2コロニーで3.3コロニーの平均数が観察された。しかし、陽性対照条件では298.3コロニーの平均数が得られた。
これにより、マイクロ焼却炉はブンゼンバーナーと同等の効果で無菌性の結果を達成した。この手順に続いて、C.Elegansのピッキングまたはチャンク化を含む任意の方法を実行することができる。したがって、それは多種多様な研究課題に適用可能である。
