Este protocolo presenta una técnica aséptica para su uso con C.Elegans que elimina la necesidad de una llama abierta. Las principales ventajas de esta técnica son que reduce los riesgos de seguridad al eliminar una llama abierta y se puede utilizar en espacios de laboratorio sin líneas de gas y en campanas de flujo laminar. Mover instrumentos dentro y fuera del área de esterilización sin tocar los lados puede ser difícil, pero agregar una guía y estabilizar la mano facilita el movimiento.
Comience conectando una guía de accesorios de soporte de bucle al microincinerador enganchándola en el cañón exterior. Conecte el microincinerador a una toma de corriente estándar de 120 o 230 voltios, según corresponda. Gire el microincinerador al ajuste Alto y deje que se caliente durante 10 a 20 minutos para alcanzar una temperatura óptima entre 800 y 825 grados centígrados.
Inserte el instrumento en el área de esterilización cilíndrica sin tocar los lados deslizándolo a lo largo de la guía. Sostenga el instrumento en el área de esterilización durante cinco a siete segundos. Retire el instrumento sin tocar los lados deslizándose hacia atrás a lo largo de la guía.
Para las púas, deje que el instrumento se enfríe durante tres a cinco segundos antes de tocar un gusano para evitar quemarlo. Después de recoger los gusanos, vuelva a insertar la selección en la cámara durante cinco a siete segundos para incinerar cualquier gusano en la selección. Conecte un quemador Bunsen a la línea de gas con tubos de goma.
Asegúrese de asegurar el tubo herméticamente y coloque el quemador lejos de los objetos superiores. Encienda el gas girando la perilla de la línea de gas. Encienda el quemador con un delantero o encendedor.
Ajuste la llama usando la perilla de gas y la entrada de aire hasta que se vea un cono azul. Sostenga el pico, la espátula o el bisturí en la llama hasta que brille en rojo. Para las púas, deje que el instrumento se enfríe durante tres a cinco segundos antes de tocar un gusano para evitar quemarlo.
Después de recoger los gusanos, vuelva a insertar el pico en la llama para incinerar cualquier gusano en el pico. Cultive la bacteria E. coli OP50 en caldo Luria durante la noche en una coctelera de 37 grados Centígrados. Después del cultivo nocturno, diluya el cultivo en agua estéril en una proporción de 1:100.
Sumerja un pico de gusano esterilizado con un quemador Bunsen o un microincinerador en la solución bacteriana, vuelva a esterilizarlo y arremolinarlo en 100 microlitros de agua estéril. Para un control positivo, sumerja el pico en solución bacteriana, gire en agua estéril y, para el control negativo, esterilice el pico sin sumergirlo en una solución bacteriana y luego agite en el agua estéril. Coloque los 100 microlitros de agua en una placa de Petri de caldo Luria de 10 centímetros, extienda el agua con un esparcidor de células estériles e incube a temperatura ambiente durante 24 horas con la tapa puesta.
Cuente las colonias manualmente después del período de incubación. La tasa de contaminación relativa se midió contando el número de colonias por muestra. En las placas de control negativas, se encontraron colonias cero.
Se obtuvo un recuento medio de 4,7 colonias con un error estándar de 0,3 colonias cuando se utilizó el quemador Bunsen para esterilizar picos. Se observó un recuento medio de 3,3 colonias con un error estándar de 1,2 colonias en la condición de microincinerador. Sin embargo, se obtuvo un recuento medio de 298,3 colonias en la condición de control positivo.
Por lo tanto, el microincinerador logró resultados de esterilidad igualmente efectivos que el quemador Bunsen. Siguiendo este procedimiento, se puede realizar cualquier método que implique la recolección o fragmentación de C.Elegans. Por lo tanto, es aplicable a una amplia variedad de preguntas de investigación.
