Dieses Protokoll stellt eine aseptische Technik für die Verwendung mit C.Elegans vor, die eine offene Flamme überflüssig macht. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie Sicherheitsrisiken reduziert, indem sie eine offene Flamme eliminiert und in Laborräumen ohne Gasleitungen und in Laminar-Flow-Hauben eingesetzt werden kann. Das Bewegen von Instrumenten in und aus dem Sterilisationsbereich, ohne die Seiten zu berühren, kann schwierig sein, aber das Hinzufügen einer Führung und die Stabilisierung Ihrer Hand erleichtert die Bewegung.
Befestigen Sie zunächst eine Schlaufenhalter-Zubehörführung an der Mikroverbrennungsanlage, indem Sie sie am Außenlauf befestigen. Schließen Sie die Mikroverbrennungsanlage an eine handelsübliche 120- oder 230-Volt-Steckdose an. Stellen Sie die Mikroverbrennungsanlage auf die Hocheinstellung und lassen Sie sie 10 bis 20 Minuten erwärmen, um eine optimale Temperatur zwischen 800 und 825 Grad Celsius zu erreichen.
Führen Sie das Instrument in den zylindrischen Sterilisationsbereich ein, ohne die Seiten zu berühren, indem Sie es entlang der Führung schieben. Halten Sie das Instrument fünf bis sieben Sekunden lang im Sterilisationsbereich. Entfernen Sie das Instrument, ohne die Seiten zu berühren, indem Sie entlang der Führung rückwärts gleiten.
Lassen Sie das Instrument drei bis fünf Sekunden abkühlen, bevor Sie einen Wurm berühren, um ein Verbrennen zu vermeiden. Nachdem Sie die Würmer gepflückt haben, setzen Sie den Meißel fünf bis sieben Sekunden lang wieder in die Kammer ein, um alle Würmer auf dem Meißel zu verbrennen. Schließen Sie einen Bunsenbrenner über Gummischläuche an die Gasleitung an.
Stellen Sie sicher, dass Sie den Schlauch fest befestigen und den Brenner von Überkopfobjekten fernhalten. Schalten Sie das Gas ein, indem Sie den Knopf an der Gasleitung drehen. Zünden Sie den Brenner mit einem Schlagbolzen oder Feuerzeug.
Stellen Sie die Flamme mit dem Gasknopf und dem Lufteinlass ein, bis ein blauer Kegel sichtbar ist. Halten Sie den Plektrum, den Spatel oder das Skalpell in der Flamme, bis es rot leuchtet. Lassen Sie das Instrument drei bis fünf Sekunden abkühlen, bevor Sie einen Wurm berühren, um ein Verbrennen zu vermeiden.
Nachdem Sie Würmer gepflückt haben, setzen Sie den Pick wieder in die Flamme ein, um alle Würmer auf dem Pick zu verbrennen. Kultur OP50 E.coli Bakterien in Luria Brühe über Nacht auf einem 37 Grad Celsius Shaker. Nach der Nachtkultur die Kultur in sterilem Wasser im Verhältnis 1:100 verdünnen.
Tauchen Sie einen mit einem Bunsenbrenner oder einer Mikroverbrennungsanlage sterilisierten Wurmpick in die Bakterienlösung, sterilisieren Sie ihn erneut und schwenken Sie ihn in 100 Mikroliter sterilem Wasser. Zur Positivkontrolle tauchen Sie den Pick in Bakterienlösung, wirbeln Sie ihn in steriles Wasser und sterilisieren Sie den Pick für die Negativkontrolle, ohne in Bakterienlösung einzutauchen, und wirbeln Sie ihn dann in das sterile Wasser. Die 100 Mikroliter Wasser auf eine 10 Zentimeter Luria Brühe Agar Petrischale auffüllen, das Wasser mit einem sterilen Zellstreuer verteilen und bei Raumtemperatur 24 Stunden mit aufgesetztem Deckel inkubieren.
Zählen Sie die Kolonien nach der Inkubationszeit manuell. Die relative Kontaminationsrate wurde gemessen, indem die Anzahl der Kolonien pro Probe gezählt wurde. In Negativkontrollplatten wurden null Kolonien gefunden.
Eine durchschnittliche Anzahl von 4,7 Kolonien mit einem Standardfehler von 0,3 Kolonien wurde erhalten, wenn der Bunsenbrenner zum Sterilisieren von Picks verwendet wurde. Eine durchschnittliche Anzahl von 3,3 Kolonien mit einem Standardfehler von 1,2 Kolonien wurde im Mikroverbrennungszustand beobachtet. In der positiven Kontrollbedingung wurde jedoch eine mittlere Anzahl von 298,3 Kolonien ermittelt.
So erzielte die Mikroverbrennungsanlage Sterilitätsergebnisse, die ebenso wirksam sind wie der Bunsenbrenner. Nach diesem Verfahren können alle Methoden durchgeführt werden, die das Pflücken oder Chunking von C.Elegans beinhalten. Somit ist es auf eine Vielzahl von Forschungsfragen anwendbar.
