Этот протокол описывает метод изучения механически вызванного кальциевого события в уротелиальном препарате ex vivo. Этот метод относительно прост в исполнении, и он может быть адаптирован для изучения механически вызванного кальциевого события в других нативных тканевых препаратах. Изготовьте микропипетки, поместив капиллярное стекло в съемник и отрегулировав его с помощью капиллярно-удерживающих ручек.
Вытяните стеклянный капилляр в два этапа в соответствии с инструкциями производителя. Закройте наконечник микропипетки с помощью микрокузницы с ручкой регулировки нагревателя, установленной на 60. Обнажив мочевой пузырь и тазовую кость усыпленной мыши, расколите тазовую кость, чтобы обнажить мочеиспускательный канал, и канюзируйте уретру с помощью катетера 24-го калибра.
Используйте шов 6-0, чтобы закрепить катетер на мочеиспускательном канале. Соберите мочевой пузырь и уретру и прикрепите их к прокладке-держателю из силиконовой резины, залитой записывающим раствором. Отделите слизистую оболочку мочевого пузыря от нижележащего мышечного слоя тонкими щипцами.
Разрежьте слизистую оболочку мочевого пузыря и прикрепите ее уротелием вверх к вставке из силиконового эластомера на дно чашки для культивирования тканей диаметром 35 миллиметров. Установите чашку для культивирования тканей с закрепленной слизистой оболочкой мочевого пузыря в столике микроскопа, оснащенном инкубатором для культивирования с резистивными нагревательными элементами. Непрерывно перфузируйте чашку для клеточных культур со скоростью 1,7 миллилитра в минуту записывающим раствором, нагретым до 37 градусов Цельсия с помощью встроенного нагревателя.
Поддерживайте температуру инкубатора и растворов для тканевых блюд примерно на уровне 37 градусов Цельсия с помощью двухканального биполярного регулятора температуры. Для регистрации механически индуцированных переходных процессов ионов кальция погрузите микропипетку в записывающий раствор. При ярком освещении, используя сканирующий объектив с малым увеличением, переместите микропипетку в центр поля.
Переместите микроманипулятор в вертикальной плоскости и отрегулируйте фокус, чтобы переместить пипетку у поверхности уротелиальной ткани. Переключитесь на объектив с большим увеличением и числовой апертурой, подходящий для иммунофлуоресценции. Установите микроманипулятор в тонкое положение и переместите пипетку в верхнюю часть клетки-мишени.
При необходимости отрегулируйте фокус и положение пипетки. Откройте протокол стимуляции в программе электрофизиологии и настройте его на воспроизведение. Отрегулируйте фокус и нажмите кнопку «Пуск» в диспетчере экспериментов, чтобы начать сбор данных.
Это приводит в действие пьезоэлектрический привод и генерирует файл с изображениями эксперимента. При стимуляции клетки наблюдается усиление флуоресценции. Чтобы количественно оценить интенсивность флуоресценции, откройте файл изображения в программном обеспечении для обработки изображений и выберите окно подсчета и измерения.
Воспроизведите фильм, чтобы идентифицировать стимулированную клетку. Выберите инструмент «Многоугольник» и нарисуйте ROI на границах ячейки, в которую было вставлено. Перейдите в окно измерения, выберите профиль интенсивности, установите для измерения значение сверхурочное, результаты — на среднее, фоновое вычитание — на нет, а затем нажмите «Выполнить».
Средняя интенсивность флуоресценции будет вычисляться с течением времени. Чтобы экспортировать данные профиля интенсивности, щелкните значок Excel в окне результатов профиля интенсивности и выполните анализ данных с помощью научного графика и программного обеспечения для анализа данных. В этом исследовании зонтичная клетка была ткнута для оценки механически вызванных переходных процессов кальция.
Изображение, полученное за 10 секунд, показывает флуоресцентный вид стимулирующей пипетки, расположенной поверх зонтичной клетки, экспрессирующей флуоресцентный датчик кальция GCaMP5G. Механическая стимуляция зонтичной клетки, экспрессирующей кальций, вызывает деформацию с последующим быстрым увеличением излучения флуоресценции. График демонстрирует изменение интенсивности флуоресценции, построенное в зависимости от времени для нескольких клеток.
Тыкание вызывает кальциевую реакцию в большинстве зонтичных клеток, трансдуцируемых флуоресцентным кальциевым датчиком. Наиболее важным этапом является сбор мочевого пузыря и мочеиспускательного канала с последующим прикреплением их к прокладке держателя из силиконовой резины. Избегайте повреждения тканей при отделении слизистой оболочки мочевого пузыря от нижележащего мышечного слоя.
Методы визуализации, подобные описанному здесь, могут дать уникальное представление о том, как механоактивируемые каналы посылают изменения в их родной среде и генерируют физиологические реакции.
