Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur Untersuchung von mechanisch evozierten Calciumereignissen in einem ex vivo urothelialen Präparat. Die Technik ist relativ einfach auszuführen und könnte angepasst werden, um mechanisch evozierte Kalziumereignisse in anderen nativen Gewebepräparaten zu untersuchen. Stellen Sie die Mikropipetten her, indem Sie das Kapillarglas in den Abzieher einsetzen und mit den Kapillarhalteknöpfen einstellen.
Ziehen Sie die Glaskapillare in zwei Schritten gemäß den Anweisungen des Herstellers. Schließen Sie die Spitze der Mikropipetten mit einer Mikroschmiede, wobei der Einstellknopf für die Heizung auf 60 eingestellt ist. Nachdem Sie die Blase und den Beckenknochen der eingeschläferten Maus freigelegt haben, knacken Sie den Beckenknochen, um die Harnröhre freizulegen, und kanülieren Sie die Harnröhre mit einem 24-Gauge-Katheter.
Verwenden Sie eine 6-0-Naht, um den Katheter an der Harnröhre zu befestigen. Ernten Sie die Blase und die Harnröhre und befestigen Sie sie an einem Silikonkautschuk-Halterpad, das in der Aufzeichnungslösung gebadet ist. Trennen Sie die Blasenschleimhaut mit einer feinen Pinzette von der darunter liegenden Muskelschicht.
Schneiden Sie die Blasenschleimhaut auf und fixieren Sie sie mit dem Urothel nach oben zu einem Silikonelastomereinsatz im Boden einer Gewebekulturschale mit einem Durchmesser von 35 Millimetern. Montieren Sie die Gewebekulturschale mit der festgesteckten Blasenschleimhaut im Mikroskoptisch, der mit einem Kulturschaleninkubator mit Widerstandsheizelementen ausgestattet ist. Perfundieren Sie die Zellkulturschale kontinuierlich mit einer Geschwindigkeit von 1,7 Millilitern pro Minute mit einer Aufzeichnungslösung, die mit einer Inline-Heizung auf 37 Grad Celsius erwärmt wurde.
Halten Sie die Temperatur des Inkubators und der Lösungen für Gewebeschalen mit einem bipolaren Zweikanal-Temperaturregler bei ca. 37 Grad Celsius. Um mechanisch induzierte Calciumionen-Transienten aufzuzeichnen, tauchen Sie die Mikropipette in die Aufzeichnungslösung. Bewegen Sie die Mikropipette bei Hellfeldbeleuchtung mit einem Scanobjektiv mit geringer Vergrößerung in die Mitte des Feldes.
Bewegen Sie den Mikromanipulator in der vertikalen Ebene und stellen Sie den Fokus so ein, dass die Pipette in die Nähe der Oberfläche des Urothelgewebes bewegt wird. Wechseln Sie zum Objektiv mit höherer Vergrößerung und numerischer Apertur, das für die Immunfluoreszenz geeignet ist. Stellen Sie den Mikromanipulator auf fein ein und bewegen Sie die Pipette in die Nähe der Oberseite der Zielzelle.
Passen Sie bei Bedarf den Fokus und die Position der Pipette an. Öffnen Sie das Stimulationsprotokoll in der Elektrophysiologie-Software und stellen Sie es auf Wiedergabe ein. Passen Sie den Fokus an und drücken Sie im Experiment-Manager auf Start, um die Datenerfassung zu starten.
Dieser steuert den piezoelektrischen Aktor an und erzeugt eine Datei mit den Bildern des Experiments. Wenn die Zelle stimuliert wird, wird eine Zunahme der Fluoreszenz beobachtet. Um die Fluoreszenzintensität zu quantifizieren, öffnen Sie die Bilddatei in der Bildgebungssoftware und wählen Sie das Zähl- und Messfenster.
Spielen Sie den Film ab, um die stimulierte Zelle zu identifizieren. Wählen Sie das Polygonwerkzeug aus, und zeichnen Sie einen ROI an den Rändern der Zelle, die gestochen wurde. Wechseln Sie zum Messfenster, wählen Sie das Intensitätsprofil aus, setzen Sie die Messung auf Überstunden, die Ergebnisse auf Durchschnitt, die Hintergrundsubtraktion auf Keine, und drücken Sie dann auf Ausführen.
Die mittlere Fluoreszenzintensität wird über die Zeit berechnet. Um die Intensitätsprofildaten zu exportieren, klicken Sie auf das Excel-Symbol im Ergebnisfenster des Intensitätsprofils und führen Sie eine Datenanalyse mit wissenschaftlicher Grafik- und Datenanalysesoftware durch. In dieser Studie wurde die Regenschirmzelle gestochen, um mechanisch evozierte Kalzium-Transienten zu beurteilen.
Das nach 10 Sekunden aufgenommene Bild zeigt eine fluoreszierende Ansicht der stimulierenden Pipette, die auf einer Regenschirmzelle positioniert ist und einen fluoreszierenden Kalziumsensor GCaMP5G exprimiert. Die mechanische Stimulation des Calciumsensors der Regenschirmzelle bewirkt eine Verformung, gefolgt von einem schnellen Anstieg der Fluoreszenzemission. Die Grafik zeigt eine Änderung der Fluoreszenzintensität, die als Funktion der Zeit für mehrere Zellen aufgetragen wird.
Das Stochern ruft in den meisten Regenschirmzellen, die mit einem fluoreszierenden Kalziumsensor transduziert werden, eine Kalziumreaktion hervor. Der wichtigste Schritt ist die Entnahme der Blase und der Harnröhre, gefolgt von der Befestigung auf einem Silikonkautschuk-Halterpad. Vermeiden Sie Gewebeschäden, wenn Sie die Blasenschleimhaut von der darunter liegenden Muskelschicht trennen.
Bildgebende Verfahren wie das hier beschriebene können einzigartige Einblicke in die Art und Weise geben, wie mechanoaktivierte Kanäle Veränderungen in ihrer natürlichen Umgebung senden und physiologische Reaktionen erzeugen.
