يصف هذا البروتوكول تقنية لدراسة حدث الكالسيوم المستحث ميكانيكيا في تحضير الظهارة البولية خارج الجسم الحي. هذه التقنية سهلة التنفيذ نسبيا ويمكن تكييفها لدراسة حدث الكالسيوم المستحث ميكانيكيا في مستحضرات الأنسجة الأصلية الأخرى. قم بتصنيع الماصات الدقيقة عن طريق وضع الزجاج الشعري في الساحب وتعديله باستخدام مقابض الاحتفاظ بالشعيرات الدموية.
اسحب الشعيرات الدموية الزجاجية على خطوتين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. أغلق طرف الماصات الدقيقة باستخدام microforge مع ضبط مقبض ضبط السخان على 60. بعد تعريض المثانة وعظم الحوض للفأر الرحيم ، قم بكسر عظم الحوض لكشف مجرى البول وقنية مجرى البول باستخدام قسطرة قياس 24.
استخدم خياطة 6-0 لتثبيت القسطرة في مجرى البول. احصد المثانة والإحليل وألصقهما على وسادة حامل من مطاط السيليكون مغمورة في محلول التسجيل. افصل الغشاء المخاطي للمثانة عن الطبقة العضلية الأساسية بالملقط الناعم.
اقطع الغشاء المخاطي للمثانة وقم بتثبيته بحيث تكون الظهارة البولية متجهة لأعلى مع إدخال مطاط صناعي من السيليكون في قاع طبق زراعة الأنسجة بقطر 35 ملم. قم بتركيب طبق زراعة الأنسجة باستخدام الغشاء المخاطي للمثانة المثبت في مرحلة المجهر المجهزة بحاضنة أطباق الثقافة مع عناصر تسخين مقاومة. قم بتغذية طبق زراعة الخلايا بشكل مستمر بمعدل 1.7 ملليلتر في الدقيقة بمحلول تسجيل يتم تسخينه عند 37 درجة مئوية باستخدام سخان مضمن.
حافظ على درجة حرارة حاضنة أطباق الأنسجة والمحاليل عند حوالي 37 درجة مئوية باستخدام جهاز تحكم في درجة الحرارة ثنائي القطب ثنائي القناة. لتسجيل عابرات أيونات الكالسيوم المستحثة ميكانيكيا ، اغمر الماصة الدقيقة في محلول التسجيل. تحت إضاءة المجال الساطع ، باستخدام هدف مسح منخفض التكبير ، انقل الماصة الدقيقة إلى مركز الحقل.
حرك المعالج الدقيق في المستوى الرأسي واضبط التركيز لتحريك الماصة بالقرب من سطح نسيج الظهارة البولية. قم بالتبديل إلى الهدف بتكبير أعلى وفتحة عددية مناسبة للتألق المناعي. اضبط المعالج الدقيق على غرامة وتحريك الماصة بالقرب من الجزء العلوي من الخلية المستهدفة.
إذا لزم الأمر ، اضبط التركيز وموضع الماصة. افتح بروتوكول التحفيز في برنامج الفيزيولوجيا الكهربية واضبطه على التشغيل. اضبط التركيز واضغط على البدء في مدير التجربة لبدء الحصول على البيانات.
يؤدي هذا إلى تشغيل المشغل الكهرضغطية وإنشاء ملف بصور التجربة. عندما يتم تحفيز الخلية ، لوحظ زيادة في مضان. لتحديد شدة الفلورسنت ، افتح ملف الصورة في برنامج التصوير وحدد نافذة العد والقياس.
قم بتشغيل الفيلم لتحديد الخلية المحفزة. حدد أداة المضلع وارسم عائد استثمار على حدود الخلية التي تم طعنها. انتقل إلى نافذة القياس ، وحدد ملف تعريف الكثافة ، واضبط القياس على العمل الإضافي ، والنتائج على المتوسط ، وطرح الخلفية على لا شيء ، ثم اضغط على تنفيذ.
سيتم حساب متوسط شدة التألق بمرور الوقت. لتصدير بيانات ملف تعريف الكثافة ، انقر فوق رمز Excel في نافذة نتائج ملف تعريف الكثافة وقم بإجراء تحليل البيانات باستخدام الرسوم البيانية العلمية وبرامج تحليل البيانات. في هذه الدراسة ، تم وخز الخلية المظلة لتقييم عابري الكالسيوم المستثارين ميكانيكيا.
تظهر الصورة التي تم التقاطها في 10 ثوان منظرا فلوريا للماصة المحفزة الموضوعة أعلى خلية مظلة تعبر عن مستشعر الكالسيوم الفلوري GCaMP5G. يؤدي التحفيز الميكانيكي للخلية المظلة التي تعبر عن مستشعر الكالسيوم إلى تشوه تليه زيادة سريعة في انبعاث التألق. يوضح التمثيل البياني تغيرا في شدة التألق المرسومة كدالة للزمن لعدة خلايا.
يثير الوخز استجابة الكالسيوم في معظم الخلايا المظلة التي يتم تحويلها باستخدام مستشعر الكالسيوم الفلوري. الخطوة الأكثر أهمية هي حصاد المثانة والإحليل ، تليها لصقها على وسادة حامل مطاط السيليكون. تجنب تلف الأنسجة عند فصل الغشاء المخاطي للمثانة عن الطبقة العضلية الأساسية.
يمكن أن توفر طرق التصوير مثل تلك الموصوفة هنا نظرة ثاقبة فريدة حول كيفية إرسال القنوات التي يتم تنشيطها ميكانيكيا للتغييرات في بيئتها الأصلية وتوليد استجابات فسيولوجية.
