このプロトコルは、ex vivo尿路上皮調製物における機械的に誘発されたカルシウム事象を研究する技術を記載する。この手法は比較的簡単に実行でき、他の天然組織調製物における機械的に誘発されるカルシウムイベントの研究に適応できます。キャピラリーガラスをプーラーに入れ、キャピラリー保持ノブで調整して、マイクロピペットを製作します。
製造元の指示に従って、ガラスキャピラリーを2つのステップで引っ張ります。ヒーター調整ノブを60に設定したマイクロフォージを使用して、マイクロピペットの先端を閉じます。安楽死させたマウスの膀胱と骨盤骨を露出させた後、骨盤骨を割って尿道を露出させ、24ゲージのカテーテルで尿道をカニューレ挿入します。
6-0縫合糸を使用して、カテーテルを尿道に固定します。膀胱と尿道を採取し、記録液に浸したシリコーンゴムホルダーパッドに貼り付けます。細かい鉗子で膀胱粘膜を下にある筋肉層から分離します。
膀胱粘膜を切り開き、直径35ミリメートルの組織培養皿の底にあるシリコーンエラストマーインサートに尿路上皮を向けて固定します。抵抗発熱体を備えた培養皿インキュベーターを備えた顕微鏡ステージに、固定された膀胱粘膜を備えた組織培養皿を取り付けます。細胞培養皿を毎分1.7ミリリットルの速度で連続的に灌流し、インラインヒーターで摂氏37度に加温した記録液を入れます。
ティッシュディッシュインキュベーターと溶液の温度を、デュアルチャンネルバイポーラ温度コントローラーを使用して摂氏約37度に維持します。機械的に誘発されるカルシウムイオントランジェントを記録するには、マイクロピペットを記録溶液に浸します。明視野照明下で、低倍率のスキャン対物レンズを使用して、マイクロピペットをフィールドの中心に移動します。
マイクロマニピュレーターを垂直面で動かし、焦点を調整してピペットを尿路上皮組織の表面近くに移動します。免疫蛍光に適した高倍率と開口数で対物レンズに切り替えます。マイクロマニピュレーターを細かく設定し、ピペットをターゲットセルの上部近くに移動します。
必要に応じて、ピペットのフォーカスと位置を調整します。電気生理学ソフトウェアで刺激プロトコルを開き、再生するように設定します。フォーカスを調整し、実験マネージャーで start キーを押してデータ取得を開始します。
これにより、圧電アクチュエータが駆動され、実験の画像を含むファイルが生成されます。細胞が刺激されると、蛍光の増加が観察される。蛍光強度を定量するには、イメージングソフトウェアで画像ファイルを開き、カウントと測定ウィンドウを選択します。
動画を再生して、刺激された細胞を特定します。ポリゴンツールを選択し、突かれたセルの境界にROIを描画します。測定ウィンドウに移動し、強度プロファイルを選択し、測定を残業に設定し、結果を平均に設定し、バックグラウンド減算をなしに設定してから、実行を押します。
平均蛍光強度は経時的に計算されます。強度プロファイルデータをエクスポートするには、強度プロファイル結果ウィンドウのExcelアイコンをクリックし、科学グラフおよびデータ分析ソフトウェアを使用してデータ分析を実行します。この研究では、機械的に誘発されたカルシウム過渡現象を評価するためにアンブレラ細胞を突いた。
10秒で撮影された画像は、蛍光カルシウムセンサーGCaMP5Gを発現する傘細胞の上に配置した刺激ピペットの蛍光ビューを示す。カルシウムセンサーを発現するアンブレラ細胞の機械的刺激は、蛍光発光の急速な増加に続く変形を引き起こす。グラフは、いくつかの細胞について時間の関数としてプロットされた蛍光強度の変化を示す。
突くと、蛍光カルシウムセンサーで形質導入されたほとんどの傘細胞でカルシウム応答が呼び起こされます。最も重要なステップは、膀胱と尿道を採取し、続いてそれらをシリコーンゴムホルダーパッドに貼り付けることです。下にある筋肉層から膀胱粘膜を分離するときは、組織の損傷を避けてください。
ここで説明するようなイメージング方法は、メカノ活性化チャネルがネイティブ環境に変化を送り、生理学的応答を生成する方法についての独自の洞察を提供します。
