Ce protocole décrit une technique permettant d’étudier un événement calcique évoqué mécaniquement dans une préparation urothéliale ex vivo. La technique est relativement facile à exécuter et pourrait être adaptée pour étudier l’événement calcique évoqué mécaniquement dans d’autres préparations tissulaires natives. Fabriquez les micropipettes en plaçant le verre capillaire dans l’extracteur et en l’ajustant avec les boutons de retenue capillaire.
Tirez le capillaire en verre en deux étapes selon les instructions du fabricant. Fermez la pointe des micropipettes à l’aide d’une microforge avec le bouton de réglage du chauffage réglé à 60. Après avoir exposé la vessie et l’os pelvien de la souris euthanasiée, fissurez l’os pelvien pour exposer l’urètre et canulez l’urètre avec un cathéter de calibre 24.
Utilisez une suture 6-0 pour fixer le cathéter à l’urètre. Récoltez la vessie et l’urètre et fixez-les sur un tampon en caoutchouc de silicone baigné dans la solution d’enregistrement. Séparez la muqueuse de la vessie de la couche musculaire sous-jacente avec une pince fine.
Coupez la muqueuse de la vessie et épinglez-la avec l’urothélium tourné vers le haut jusqu’à un insert en élastomère de silicone dans le fond d’une boîte de culture tissulaire de 35 millimètres de diamètre. Montez la capsule de culture tissulaire avec la muqueuse de la vessie épinglée dans l’étage microscope équipé d’un incubateur à plat de culture avec des éléments chauffants résistifs. Perfuser la capsule de culture cellulaire en continu à un débit de 1,7 millilitre par minute avec une solution d’enregistrement chauffée à 37 degrés Celsius avec un chauffage en ligne.
Maintenez la température de l’incubateur à vaisselle en tissu et des solutions à environ 37 degrés Celsius avec un régulateur de température bipolaire à double canal. Pour enregistrer les transitoires d’ions calcium induits mécaniquement, immergez la micropipette dans la solution d’enregistrement. Sous éclairage en fond clair, à l’aide d’un objectif de balayage à faible grossissement, déplacez la micropipette vers le centre du champ.
Déplacez le micromanipulateur dans le plan vertical et ajustez la mise au point pour déplacer la pipette près de la surface du tissu urothélial. Passez à l’objectif avec un grossissement plus élevé et une ouverture numérique adaptée à l’immunofluorescence. Réglez le micromanipulateur pour qu’il affine et déplacez la pipette près du haut de la cellule cible.
Si nécessaire, réglez la mise au point et la position de la pipette. Ouvrez le protocole de stimulation dans le logiciel d’électrophysiologie et réglez-le pour jouer. Ajustez la mise au point et appuyez sur Démarrer dans le gestionnaire d’expériences pour lancer l’acquisition des données.
Cela pilote l’actionneur piézoélectrique et génère un fichier avec les images de l’expérience. Lorsque la cellule est stimulée, une augmentation de la fluorescence est observée. Pour quantifier l’intensité fluorescente, ouvrez le fichier image dans le logiciel d’imagerie et sélectionnez la fenêtre de comptage et de mesure.
Lisez le film pour identifier la cellule stimulée. Sélectionnez l’outil polygone et dessinez un retour sur investissement sur les limites de la cellule qui a été percée. Accédez à la fenêtre de mesure, sélectionnez le profil d’intensité, définissez la mesure sur les heures supplémentaires, les résultats sur la moyenne, la soustraction d’arrière-plan sur aucune, puis appuyez sur Exécuter.
L’intensité moyenne de fluorescence sera calculée au fil du temps. Pour exporter les données du profil d’intensité, cliquez sur l’icône Excel dans la fenêtre des résultats du profil d’intensité et effectuez une analyse des données à l’aide d’un logiciel de représentation graphique et d’analyse de données scientifiques. Dans cette étude, la cellule parapluie a été piquée pour évaluer les transitoires de calcium évoqués mécaniquement.
L’image capturée à 10 secondes montre une vue fluorescente de la pipette stimulante positionnée au-dessus d’une cellule parapluie exprimant un capteur de calcium fluorescent GCaMP5G. La stimulation mécanique de la cellule parapluie exprimant le capteur de calcium provoque une déformation suivie d’une augmentation rapide de l’émission de fluorescence. Le graphique montre un changement dans l’intensité de fluorescence tracée en fonction du temps pour plusieurs cellules.
Le piqûre évoque une réponse calcique dans la plupart des cellules parapluies transduite avec un capteur de calcium fluorescent. L’étape la plus importante consiste à prélever la vessie et l’urètre, puis à les fixer sur un tampon de support en caoutchouc de silicone. Évitez les lésions tissulaires lors de la séparation de la muqueuse de la vessie de la couche musculaire sous-jacente.
Les méthodes d’imagerie telles que celle décrite ici peuvent fournir un aperçu unique de la façon dont les canaux activés par mécano envoient des changements dans leur environnement natif et génèrent des réponses physiologiques.
