이 프로토콜은 생체 외 요로상피 제제에서 기계적으로 유발된 칼슘 이벤트를 연구하는 기술을 설명합니다. 이 기술은 비교적 실행하기 쉽고 다른 천연 조직 제제에서 기계적으로 유발된 칼슘 이벤트를 연구하는 데 적용할 수 있습니다. 캐필러리 유리를 풀러에 놓고 캐필러리 고정 손잡이로 조정하여 마이크로피펫을 제작합니다.
제조업체의 지침에 따라 유리 모세관을 두 단계로 당깁니다. 히터 조정 손잡이가 60으로 설정된 상태에서 마이크로포지를 사용하여 마이크로피펫 끝을 닫습니다. 안락사된 쥐의 방광과 골반뼈를 노출시킨 후 골반뼈를 부수어 요도를 노출시키고 24게이지 카테터로 요도를 캐뉼라합니다.
6-0 봉합사를 사용하여 카테터를 요도에 고정합니다. 방광과 요도를 채취하여 기록 용액에 적신 실리콘 고무 홀더 패드에 부착합니다. 미세한 집게로 방광 점막을 밑에있는 근육층에서 분리하십시오.
방광 점막을 잘라내고 요로상피가 직경 35mm의 조직 배양 접시 바닥에 있는 실리콘 엘라스토머 삽입물을 향하도록 고정합니다. 저항성 발열체가 있는 배양 접시 인큐베이터가 장착된 현미경 단계에서 고정된 방광 점막이 있는 조직 배양 접시를 장착합니다. 인라인 히터로 섭씨 37도에서 데워진 기록 용액을 사용하여 분당 1.7밀리리터의 속도로 세포 배양 접시를 지속적으로 관류합니다.
이중 채널 양극성 온도 컨트롤러를 사용하여 티슈 접시 인큐베이터와 용액의 온도를 약 섭씨 37도로 유지합니다. 기계적으로 유도된 칼슘 이온 과도 현상을 기록하려면 마이크로피펫을 기록 용액에 담그십시오. 명시야 조명 아래에서 저배율 스캐닝 대물렌즈를 사용하여 마이크로피펫을 필드 중앙으로 이동합니다.
수직면에서 미세 매니퓰레이터를 이동하고 초점을 조정하여 요로 상피 조직의 표면 근처로 피펫을 움직입니다. 면역형광에 적합한 더 높은 배율과 개구수를 가진 대물렌즈로 전환하십시오. 미세 매니퓰레이터를 미세하게 설정하고 피펫을 대상 셀의 상단 근처로 이동합니다.
필요한 경우 피펫의 초점과 위치를 조정하십시오. 전기 생리학 소프트웨어에서 자극 프로토콜을 열고 재생하도록 설정합니다. 실험 관리자에서 초점을 조정하고 시작을 눌러 데이터 수집을 시작합니다.
이것은 압전 액추에이터를 구동하고 실험 이미지가 포함된 파일을 생성합니다. 세포가 자극되면 형광의 증가가 관찰됩니다. 형광 강도를 정량화하려면 이미징 소프트웨어에서 이미지 파일을 열고 카운트 및 측정 창을 선택합니다.
동영상을 재생하여 자극된 세포를 식별합니다. 다각형 도구를 선택하고 찌른 셀의 경계에 ROI를 그립니다. 측정 창으로 이동하여 강도 프로파일을 선택하고, 측정을 초과 근무로, 결과를 평균으로, 배경 빼기를 없음으로 설정한 다음 실행을 누릅니다.
평균 형광 강도는 시간이 지남에 따라 계산됩니다. 강도 프로파일 데이터를 내보내려면 강도 프로파일 결과 창에서 Excel 아이콘을 클릭하고 과학 그래프 및 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행합니다. 이 연구에서는 기계적으로 유발된 칼슘 과도 현상을 평가하기 위해 우산 세포를 찔렀습니다.
10초에 캡처된 이미지는 형광 칼슘 센서 GCaMP5G를 발현하는 우산 셀 위에 위치한 자극 피펫의 형광 보기를 보여줍니다. 칼슘을 발현하는 우산 세포의 기계적 자극 센서는 형광 방출의 급격한 증가에 이어 변형을 일으킨다. 그래프는 여러 세포에 대한 시간의 함수로 표시된 형광 강도의 변화를 보여줍니다.
찌르는 것은 형광 칼슘 센서로 형질도입된 대부분의 우산 세포에서 칼슘 반응을 불러일으킵니다. 가장 중요한 단계는 방광과 요도를 채취한 다음 실리콘 고무 홀더 패드에 부착하는 것입니다. 밑에있는 근육층에서 방광 점막을 분리 할 때 조직 손상을 피하십시오.
여기에 설명된 것과 같은 이미징 방법은 기계 활성화 채널이 기본 환경에서 변화를 보내고 생리학적 반응을 생성하는 방법에 대한 고유한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
