פרוטוקול זה מתאר טכניקה לחקר אירוע סידן המתעורר באופן מכני בתכשיר דרכי השתן ex vivo. הטכניקה קלה יחסית לביצוע וניתן להתאים אותה לחקר אירוע סידן המעורר מכנית בתכשירים אחרים של רקמות מקומיות. לייצר את micropipettes על ידי הנחת זכוכית נימי במושך ולהתאים אותו עם ידיות תומכות נימים.
משוך את נימי הזכוכית בשני שלבים בהתאם להוראות היצרן. סגור את קצה המיקרופיפטות באמצעות מיקרופורג' עם ידית כוונון החימום המוגדרת על 60. לאחר חשיפת שלפוחית השתן ועצם האגן של העכבר שעבר המתת חסד, יש לפצח את עצם האגן כדי לחשוף את השופכה ולסדר את השופכה באמצעות צנתר בעל 24 מד.
השתמש בתפר 6-0 כדי לאבטח את הצנתר לשופכה. קצרו את שלפוחית השתן והשופכה והצמידו אותם לכרית מחזיק גומי סיליקון הטובלת בתמיסת ההקלטה. יש להפריד את רירית שלפוחית השתן מהשכבה השרירית שמתחתיה בעזרת מלקחיים עדינים.
חתכו את רירית שלפוחית השתן והצמידו אותה כלפי מטה כשהאורותליום פונה כלפי מעלה לאלסטומר סיליקון בתחתית צלחת תרבית רקמה בקוטר 35 מילימטר. הרכיבו את צלחת תרבית הרקמה עם רירית שלפוחית השתן המוצמדת בשלב המיקרוסקופ המצוידת באינקובטור צלחת תרבית עם גופי חימום התנגדותיים. מחוררים את צלחת תרבית התאים ברציפות בקצב של 1.7 מיליליטר לדקה עם תמיסת הקלטה המחוממת ב 37 מעלות צלזיוס עם תנור בתוך השורה.
שמור על הטמפרטורה של אינקובטור צלחת הרקמה ותמיסות על כ 37 מעלות צלזיוס עם בקר טמפרטורה דו קוטבי דו-ערוצי. כדי להקליט מעברי יוני סידן המושרים באופן מכני, השקיעו את המיקרופיפטה בתמיסת ההקלטה. תחת תאורת שדה בהיר, באמצעות מטרת סריקה בהגדלה נמוכה, הזז את המיקרופיפטה למרכז השדה.
הזז את המיקרומניפולטור במישור האנכי וכוונן את המיקוד כדי להזיז את פיפטה קרוב לפני השטח של רקמת השתן. עבור למטרה עם הגדלה גבוהה יותר וצמצם מספרי המתאים לאימונופלואורסצנציה. הגדר את המיקרומניפולטור לדק והזז את פיפטה קרוב לחלק העליון של תא היעד.
במידת הצורך, להתאים את המוקד ואת המיקום של פיפטה. פתח את פרוטוקול הגירוי בתוכנת האלקטרופיזיולוגיה והגדר אותו להפעלה. התאם את המוקד ולחץ על התחל במנהל הניסוי כדי להתחיל באיסוף נתונים.
זה מניע את המפעיל הפיזואלקטרי ומייצר קובץ עם התמונות של הניסוי. כאשר התא מגורה, נצפתה עלייה בפלואורסצנטיות. לכימות עוצמת הפלואורסצנט, פתחו את קובץ התמונה בתוכנת ההדמיה ובחרו בחלון הספירה והמדידה.
הפעל את הסרט כדי לזהות את התא המגורה. בחר בכלי מצולע וצייר החזר השקעה על גבולות התא שנדקר. עבור אל חלון המדידה, בחר פרופיל עוצמה, הגדר את המדידה לשעות נוספות, את התוצאות לממוצע, את חיסור הרקע לאפס ולאחר מכן לחץ על הפעל.
עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת תחושב לאורך זמן. כדי לייצא את נתוני פרופיל העוצמה, לחץ על סמל Excel בחלון התוצאות של פרופיל העוצמה ובצע ניתוח נתונים באמצעות תוכנת גרפים וניתוח נתונים מדעית. במחקר זה, תא המטריה נדקר כדי להעריך מעברי סידן המתעוררים באופן מכני.
התמונה שצולמה לאחר 10 שניות מראה תצוגה פלואורסצנטית של פיפטה מגרה הממוקמת על גבי תא מטריה המבטא חיישן סידן פלואורסצנטי GCaMP5G. גירוי מכני של תא המטריה המבטא חיישן סידן גורם לעיוות ואחריו עלייה מהירה בפלואורסצנטיות. הגרף מדגים שינוי בעוצמת הפלואורסצנטיות המתוארת כפונקציה של זמן עבור מספר תאים.
חיטוט מעורר תגובת סידן ברוב תאי המטריה המומרים באמצעות חיישן סידן פלואורסצנטי. השלב החשוב ביותר הוא קצירת שלפוחית השתן והשופכה, ולאחר מכן הצמדתם לכרית מחזיק גומי מסיליקון. הימנע נזק לרקמות בעת הפרדת רירית שלפוחית השתן מן השכבה השרירית הבסיסית.
שיטות הדמיה כמו זו המתוארת כאן יכולות לספק תובנה ייחודית כיצד ערוצים המופעלים על ידי מכנו שולחים שינויים בסביבתם הטבעית ויוצרים תגובות פיזיולוגיות.
