Questo protocollo descrive una tecnica per studiare l'evento di calcio evocato meccanicamente in un preparato uroteliale ex vivo. La tecnica è relativamente facile da eseguire e potrebbe essere adattata per studiare eventi di calcio evocati meccanicamente in altre preparazioni tissutali native. Fabbricare le micropipette posizionando il vetro capillare nell'estrattore e regolandolo con le manopole di fissaggio capillare.
Tirare il capillare di vetro in due passaggi secondo le istruzioni del produttore. Chiudere la punta delle micropipette utilizzando una microforgia con la manopola di regolazione del riscaldatore impostata su 60. Dopo aver esposto la vescica e l'osso pelvico del topo eutanasia, rompere l'osso pelvico per esporre l'uretra e cannulare l'uretra con un catetere di calibro 24.
Utilizzare una sutura 6-0 per fissare il catetere all'uretra. Raccogliere la vescica e l'uretra e fissarle su un supporto in gomma siliconica immerso nella soluzione di registrazione. Separare la mucosa della vescica dallo strato muscolare sottostante con una pinza fine.
Tagliare la mucosa della vescica e fissarla con l'urotelio rivolto verso l'alto fino a un inserto in elastomero siliconico sul fondo di una capsula di coltura tissutale di 35 millimetri di diametro. Montare il piatto di coltura tissutale con la mucosa della vescica appuntata nella fase del microscopio dotata di un incubatore di piatti di coltura con elementi riscaldanti resistivi. Perfondere continuamente il piatto di coltura cellulare ad una velocità di 1,7 millilitri al minuto con una soluzione di registrazione riscaldata a 37 gradi Celsius con un riscaldatore in linea.
Mantenere la temperatura dell'incubatore di tessuti e delle soluzioni a circa 37 gradi Celsius con un regolatore di temperatura bipolare a doppio canale. Per registrare i transitori di ioni calcio indotti meccanicamente, immergere la micropipetta nella soluzione di registrazione. Sotto l'illuminazione a campo chiaro, utilizzando un obiettivo di scansione a basso ingrandimento, spostare la micropipetta al centro del campo.
Spostare il micromanipolatore sul piano verticale e regolare la messa a fuoco per spostare la pipetta vicino alla superficie del tessuto uroteliale. Passa all'obiettivo con un ingrandimento più elevato e un'apertura numerica adatta all'immunofluorescenza. Impostare il micromanipolatore in modo fine e spostare la pipetta vicino alla parte superiore della cella di destinazione.
Se necessario, regolare la messa a fuoco e la posizione della pipetta. Aprire il protocollo di stimolazione nel software di elettrofisiologia e impostarlo per giocare. Regolare lo stato attivo e premere Start in Gestione esperimenti per avviare l'acquisizione dei dati.
Questo aziona l'attuatore piezoelettrico e genera un file con le immagini dell'esperimento. Quando la cellula viene stimolata, si osserva un aumento della fluorescenza. Per quantificare l'intensità fluorescente, aprire il file di immagine nel software di imaging e selezionare la finestra di conteggio e misurazione.
Riproduci il filmato per identificare la cellula stimolata. Selezionare lo strumento poligono e disegnare un ROI sui confini della cella che è stata colpita. Vai alla finestra di misurazione, seleziona il profilo di intensità, imposta la misurazione su straordinario, i risultati su media, la sottrazione dello sfondo su nessuno, quindi premi Esegui.
L'intensità media della fluorescenza sarà calcolata nel tempo. Per esportare i dati del profilo di intensità, fare clic sull'icona Excel nella finestra dei risultati del profilo di intensità ed eseguire l'analisi dei dati utilizzando il software di grafica scientifica e analisi dei dati. In questo studio, la cellula ombrello è stata colpita per valutare i transitori di calcio evocati meccanicamente.
L'immagine catturata a 10 secondi mostra una vista fluorescente della pipetta stimolante posizionata sopra una cella ad ombrello che esprime un sensore di calcio fluorescente GCaMP5G. La stimolazione meccanica della cellula ombrello che esprime il sensore di calcio provoca una deformazione seguita da un rapido aumento dell'emissione di fluorescenza. Il grafico mostra un cambiamento nell'intensità della fluorescenza tracciata in funzione del tempo per diverse cellule.
Il poking evoca una risposta di calcio nella maggior parte delle cellule ombrello trasdotte con un sensore di calcio fluorescente. Il passo più importante è la raccolta della vescica e dell'uretra, seguita dall'apposizione su un cuscinetto di supporto in gomma siliconica. Evitare danni ai tessuti quando si separa la mucosa della vescica dallo strato muscolare sottostante.
I metodi di imaging come quello qui descritto possono fornire una visione unica di come i canali attivati dalla meccanoa inviano cambiamenti nel loro ambiente nativo e generano risposte fisiologiche.
