Ce protocole décrit une méthode pour dépister rapidement des milliers de génomes à l’aide de spermatozoïdes de poisson zèbre injecté par F0 CRISPR. Cette technique est avantageuse dans son accessibilité. Plutôt que des approches coûteuses et spécialisées basées sur le séquençage, notre méthode utilise des enzymes de restriction PCR et l’électrophorèse sur gel pour dépister les porteurs mâles F0 pour détecter les indels ou les modifications spécifiques du génome.
La partie la plus difficile de cette procédure est d’obtenir le sperme rapidement, mais cela devient une bonne technique pour la fécondation in vitro si nous travaillons avec beaucoup de poissons dysmorphes, et c’est donc un moyen facile pour nous de croiser des poissons qui nous causent des problèmes. Commencez par installer des bassins d’élevage pour les poissons de type sauvage et F0 et incuber les réservoirs pendant la nuit. Après avoir anesthésié le poisson mâle le lendemain, utilisez une cuillère à fente pour le transférer sur une pile de serviettes en papier propres.
Rouler doucement le poisson pour enlever l’excès d’eau. Enlevez toute eau en la séchant avec un mouchoir en papier plié propre. À l’aide de la cuillère fendue, transférer le poisson dans l’éponge préparée.
Placez le poisson côté ventral vers le haut et épongez doucement la zone autour des nageoires anales avec un papier de soie plié propre. Pour recueillir le sperme, utilisez un tube capillaire pour éloigner doucement les nageoires pelviennes de la ligne médiane, exposant ainsi le cloaque. Placez le tube capillaire près du cloaque.
Avec vos doigts ou une paire de pinces filtrantes, pressez doucement les côtés du poisson des branchies vers le bas. En utilisant l’action capillaire, recueillir le sperme dans le tube et le placer dans un tube PCR contenant 40 microlitres de solution d’hydroxyde de sodium 50 millimolaires, puis expulser l’échantillon dans le tube. Après avoir fait tourner les échantillons de sperme dans une mini-centrifugeuse, placez les tubes PCR dans un cycleur thermique.
Faites fonctionner le cycleur en chauffant les échantillons pendant 40 minutes à 95 degrés Celsius, puis en refroidissant à 25 degrés Celsius. Après avoir retiré les échantillons du cycleur, neutraliser le pH en ajoutant 10 microlitres d’un chlorhydrate de tris molaire de pH huit. Mélanger en aspirant la suspension puis centrifuger les échantillons.
Réglez le thermocycleur à 95 degrés Celsius pour le préchauffage. Et en attendant, préparez 25 microlitres du mélange réactionnel PCR pour chaque échantillon de sperme. Bien mélanger en pipetant de haut en bas, puis faire tourner les échantillons.
Placez les échantillons dans le thermocycleur préchauffé et réglez le cycle. Pour obtenir une solution de gel, micro-ondes une solution de gel d’agarose à 4% préparée en mélangeant de la poudre d’agarose, de la coloration de gel et du tampon de TBE. Versez la solution de gel dans un cadre de coulée en gel et insérez un peigne d’un côté.
Après solidification du gel, retirez délicatement le peigne. Placez le gel dans une plate-forme d’électrophorèse de telle sorte que les puits soient les plus proches de l’électrode négative. Versez le tampon de fonctionnement TBE dans la plate-forme jusqu’à ce que les puits soient complètement submergés.
Commencez à charger le gel en pipetant cinq microlitres d’échelle d’ADN dans le premier puits. Chargez les puits restants avec 5 à 10 microlitres du produit PCR. Faites fonctionner le gel pendant 1 heure à 150 volts pour assurer une séparation adéquate des amplicons.
Utilisez l’imageur de gel pour visualiser les bandes d’ADN. L’analyse du locus p2RY12 a montré que l’amplicon de type sauvage affichait une seule bande de 250 paires de bases tandis que les amplicons mâles injectés F0 contenant des indels fonctionnaient comme plusieurs bandes. L’analyse du locus dnah10 a montré que l’amplicon de type sauvage fonctionne comme une seule bande longue de 400 paires de bases.
Les amplicons mâles injectés F0 contenant des indels fonctionnaient comme plusieurs bandes ou comme une seule bande avec une mobilité réduite du gel. Le numéro un masculin injecté F0 avait une bande supplémentaire dans le produit digéré, qui était absente dans le produit PCR, ce qui en faisait le meilleur candidat fondateur pour l’établissement de la ligne knock-in mutante. Si un poisson mâle ne produit pas de spermatozoïdes lorsqu’il est pressé, il est préférable de reposer le poisson pendant une semaine et d’essayer à nouveau au lieu de le presser trop fort et de risquer de le blesser.
Une fois que le FC ou le fondateur masculin est croisé, les allèles doivent être vérifiés dans la progéniture F1. Séquençer directement les amplicons F1 et effectuer une analyse des allèles hétérozygotes est un moyen facile de le faire.
