Протокол в этом исследовании обеспечивает комбинированную стратегию двух трав для лечения поврежденных гипоксией клеток PC12 и ссылку для оптимизации наилучшего комбинированного режима трав. Этот метод может обеспечить простой, надежный и эффективный экспериментальный метод in vitro для скрининга эффективной комбинации ингредиентов из трав против гипоксиальных клеток. Эта стратегия также может быть применена для скрининга комбинаций компонентов против гипоксиальных клеток из других комбинаций препаратов трав и иллюстрации их защитного механизма.
Для начала субкультурировать клетки PC12 каждые два-три дня при 37 градусах Цельсия в инкубаторе, дополненном 5% углекислым газом, чтобы получить проход от 4 до 8 для всех последующих экспериментов. Обработайте от 70 до 80% сливающихся клеток PC12 одним миллилитром 0,25% трипсина и наблюдайте за клетками под микроскопом для отслоения клеток. Затем остановите переваривание трипсина, добавив три миллилитра полной среды.
Раскрутите перенесенные ячейки в 15-миллилитровой центрифужной трубке при 840 х г в течение пяти минут. После выброса супернатанта повторно суспендируют ячейку гранулы с полной средой и перенесут клеточную суспензию в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку. Чтобы подсчитать клетки, запустите программное обеспечение проточной цитометрии и выберите соответствующее разбавление, кратное клеточному раствору, в настройках подсчета.
Щелкните диаграмму плотности после загрузки образца ячейки. Обведите популяцию ячеек в стороне от осей X и Y. Щелкните правой кнопкой мыши таблицу данных под рисунком и выберите X, Y, Count и Abs.
Count, чтобы получить результаты подсчета ячеек в таблице данных Abs.Count. После регулировки концентрации в клетках приблизительно до 1 раза 10 до 5-й ячейки на миллилитр с полной средой добавляют 100 микролитров клеточной суспензии на лунку к 96-луночной пластине и инкубируют при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 24 часов. На следующий день к выбрасываемой супернатантной пластине добавляют 120 микролитров по одному миллиграмму на миллилитр раствора МТТ в каждую лунку, и насиживают в течение четырех часов при 37 градусах Цельсия.
После инкубации, как только супернатант будет выброшен, добавьте 150 микролитров ДМСО в каждую лунку. Держите пластину при встряхивании в вихревом осцилляторе в течение 10 минут со скоростью 240 раз в минуту. Затем измерьте поглощение на 490 нанометров в микропластинчатом считывателе.
Чтобы провести скрининг оптимальной комбинации препаратов методом гомогенной конструкции, культивируйте клетки, как было продемонстрировано ранее, и обработайте поврежденные клетки PC12 шестью различными пропорциями концентраций инъекции астрагала и капсулы бревискапа. Чтобы оценить защитный эффект двух оптимальных комбинаций, обработайте поврежденные клетки PC12 двумя типами комбинаций препаратов. Инкубируйте клетки в течение 24 часов и рассчитайте жизнеспособность клеток, как было продемонстрировано ранее.
Посейте клетки PC12 в 12-луночную пластину и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение 24 часов. После медикаментозного лечения обработайте клетки 250 микролитрами трипсина на лунку и центрифугируйте клетки при 840 х г в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем повторно суспендируют ячейку гранулы с 500 микролитрами связывающего буфера.
Добавьте 5 микролитров Annexin V-FITC, 10 микролитров йодида пропидия в трипликатах для каждой группы и инкубируйте клетки в темноте в течение 15 минут при комнатной температуре, чтобы проверить наличие апоптоза с помощью проточной цитометрии. В программном обеспечении проточного цитометра щелкните Автоматическая компенсация в меню Пуск, выберите FITC, PE, PerCP и APC в канале Выбора и выберите Компенсация на высоте. Затем нажмите кнопку ОК в поле Статистический элемент:Медиана.
Щелкните Карта плотности и обведите эффективную популяцию клеток с помощью метода подсчета клеток, продемонстрированного ранее. С флуоресценцией FITC в качестве параметра оси X и другой флуоресценцией в качестве параметра оси Y создайте карту плотности. Нажмите «Матрица компенсаций» в меню «Пуск» и «Коэффициент» в матрице переполнения.
Засейте клетки PC12 в крышки, помещенные на 24-луночную пластину в трех экземплярах, и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение 24 часов. После медикаментозной обработки дважды промойте крышки PBS в течение пяти минут каждый, зафиксируйте их 4% параформальдегидом в течение 15 минут и пронизывайте 0,5% Triton X-100 в течение 20 минут при комнатной температуре. После промывания клеток заблокируйте их 10% козьей сывороткой на один час при комнатной температуре.
Добавьте 200 микролитров разбавленного первичного антитела каспазы-3 к каждому покровному листу и инкубируйте в течение ночи при 4 градусах Цельсия. На следующий день промыть три раза буфером TBST в течение трех минут каждый и инкубировать с 200 микролитрами вторичных антител в течение одного часа при комнатной температуре в темноте. После инкубации инкубируют покровные листы с 300 микролитрами по 0,5 мкг на миллилитр DAPI в течение 10 минут и трижды промывают клетки TBST в течение пяти минут каждая.
Захватите снимки под флуоресцентным микроскопом и статистически проанализируйте интенсивность флуоресценции с помощью программного обеспечения для визуализации. Промыть обработанный препаратом клеточный покров PC12 три раза PBS в течение трех минут каждый и инкубировать с 400 микролитрами 10 микромолярного дихлор-дигидро-флуоресцеинового диацетата при 37 градусах Цельсия в течение 20 минут. Снова промыть клетки dmem без сыворотки дважды в течение трех минут каждая.
Добавьте флуоресцентный закалочный агент и немедленно захватите снимки крышки под флуоресцентным микроскопом, чтобы рассчитать относительную интенсивность флуоресценции с помощью программного обеспечения для визуализации. Промыть обработанные препаратом клетки PC12 в 6-луночной пластине три раза с PBS в течение пяти минут каждая и инкубировать на льду в течение 30 минут в подготовленном буфере лизиса по 100 микролитров на лунку. После лизиса центрифугируют клетки при 16 000 х г в течение 20 минут при 4 градусах Цельсия, чтобы собрать супернатант.
После обнаружения концентрации белка с помощью анализа Брэдфорда запустите 12%-ный электрофорез SDS-PAGE с 25 микрограммами белка в каждой полосе и перенесите гель на мембрану PVDF. Блокируют мембраны 5% обезжиренным молоком в течение 1,5 часов при комнатной температуре и инкубируют с пятью миллилитрами соответствующих первичных антител в течение 24 часов при 4 градусах Цельсия. После инкубации и промывки мембраны TBST три раза по 10 минут каждый инкубируют с пятью миллилитрами вторичных HRP-конъюгированных антител при комнатной температуре в течение двух часов.
Наконец, к мембране, промытой TBST, добавьте хемилюминесцентный субстрат HRP для обнаружения белковых полос в соответствии с инструкцией производителя. Затем захватите изображения, используя систему визуализации хемилюминесценции для количественной оценки серых значений белков, с бета-актином в качестве внутреннего контроля. Жизнеспособность клеток на нормальных клетках PC12 была ниже 95% при инъекции астрагала при концентрациях более 12 микромоляров и более 5 микромоляров для капсулы бревискапа.
Инъекция астрагала может улучшить выживаемость поврежденных клеток PC12 в диапазоне концентраций от 6 до 12 микромоляров, а капсулы breviscapus - от 2 до 5 микромоляров. Тогда как комбинация препарата в соотношении 6 к 1,8 микромолярам проявляла наивысшую жизнеспособность клеток. Жизнеспособность клеток двух комбинаций на поврежденных клетках PC12 значительно повысилась, а комбинация компонентов превосходила комбинацию препаратов.
Частота апоптоза показала, что процент ранних, поздних и общих апоптотических клеток был значительно выше в модельной группе, чем в нормальной группе. По сравнению с модельной группой, процент апоптотических клеток на каждой стадии был значительно ниже в группе лечения. Интенсивность флуоресценции каспазы-3 была значительно ниже в каждой группе лечения по сравнению с модельной группой и была относительно ниже в группе комбинации компонентов.
Относительная экспрессия генов Akt, Bcl-2 и Bax показала, что комбинация компонентов превосходит комбинацию препаратов в содействии выживанию клеток, что связано с более сильным антиапоптозным эффектом. Комбинация компонентов продемонстрировала лучший антиоксидантный эффект повреждения, чем у комбинации препаратов, и значительно более высокую экспрессию белка Nrf2. Этот метод может быть использован для скрининга и оценки комбинации компонентов с другими потенциальными фармакологическими активностями из комбинации трав, такими как противовоспалительные, антибактериальные и другие.
