Analisi dei complessi della proteina di membrana tilacoide mediante elettroforesi nativa blu

Riepilogo

Un protocollo per la delucidazione della pianta thylakoid proteina complessa organizzazione e composizione con blu nativo poliacrilammide gel elettroforesi (BN-PAGE) e 2D-SDS-PAGE è descritto. Il protocollo è ottimizzato per Arabidopsis thaliana, , ma può essere utilizzato per altre specie di piante con modifiche minori.

Abstract

Catena di trasporto fotosintetiche dell'elettrone (ecc) converte energia solare in energia chimica sotto forma di NADPH e ATP. Quattro complessi proteici grande incorporato nell'energia solare raccolta membrana tilacoide per guidare gli elettroni dall'acqua a NADP⁺ via due fotosistema e utilizzare la pendenza del protone creato per la produzione di ATP. Photosystem PSII, PSI, citocromo b₆f (Cyt b₆f) e dell'atpasi sono tutti i complessi multiproteici con orientamento distinto e dinamiche nella membrana tilacoide. Preziose informazioni circa la composizione e le interazioni dei complessi della proteina nella membrana tilacoide ottenibile da solubilizzare i complessi dall'integrità della membrana di detergenti delicati, seguite dalla separazione elettroforetica di Natale del gel della complessi. L'elettroforesi Natale blu del gel di poliacrilammide (BN-PAGE) è un metodo analitico utilizzato per la separazione dei complessi della proteina nella loro forma nativa e funzionale. Il metodo può essere utilizzato per la purificazione della proteina di complessi per più dettagliata analisi strutturale, ma fornisce anche uno strumento per analizzare le interazioni dinamiche tra i complessi di proteine. Il metodo è stato sviluppato per l'analisi dei complessi della proteina respiratoria mitocondriale, ma da allora ha stato ottimizzato e migliorato per la dissezione dei complessi proteici thylakoid. Qui, forniamo un dettagliato protocollo sono aggiornato per l'analisi di complessi proteici fotosintetici labile e le loro interazioni in Arabidopsis thaliana.

Introduzione

Grande proteina del multisubunit complessi fotosistema PSI e PSII, Cyt b₆f e dell'atpasi coordinare la produzione di ATP e NADPH in reazioni fotosintetiche di luce. Nei cloroplasti di piante superiori, i complessi si trovano nella membrana tilacoide, che è una struttura a membrana strutturalmente eterogenee, che comprende appressed grana e lo stroma non appressed tilacoidi. L'elettroforesi Natale blu del gel di poliacrilammide (BN-PAGE) è un metodo ampiamente usato nell'analisi dei complessi della proteina del multisubunit grande nella loro forma nativa e biologicamente attivo. Il metodo è stato istituito per la dissezione della membrana mitocondriale della proteina complessi¹, ma più successivamente è stato personalizzato per la separazione dei complessi della proteina dalla membrana tilacoide rete³. Il metodo è adatto (i) per la purificazione dei complessi della proteina thylakoid individuali per l'analisi strutturale, (ii) per determinare interazioni natali tra complessi proteici e (iii) per l'analisi dell'organizzazione complessiva dei complessi proteici Dopo aver cambiato il stimoli ambientali.

Prima della separazione, complessi proteici sono isolati dalla membrana con detergenti non ionici attentamente selezionate, che sono generalmente lievi e preservare la struttura nativa dei complessi proteici. Detersivi contengono idrofobo e idrofilici siti e micelle stabile forma sopra una certa concentrazione, chiamato una concentrazione micellare critica (CMC). Aumento della concentrazione di detersivo sopra i risultati di CMC in rottura delle interazioni lipido-lipidico e la solubilizzazione dei complessi della proteina. La scelta di detersivo dipende sulla stabilità della proteina complessa di interesse e la capacità di solubilizzazione del detergente. Ordinariamente usati detergenti sono α/β-dodecil-maltoside e digitonina. La solubilizzazione dei complessi della proteina nel loro stato nativo, materiale insolubile viene rimosso mediante centrifugazione. Nelle piante superiori, la membrana tilacoide è altamente eterogeneo in struttura e alcuni detersivi (ad es., digitonina) solubilizzano selettivamente solo una specifica frazione della membrana³. Pertanto, per caratterizzare l'organizzazione complessa di proteine o le interazioni tra i complessi di proteine, è cruciale determinare sempre la capacità di solubilizzazione del detergente scelto attraverso la determinazione del contenuto di clorofilla e la clorofilla a/b rapporto del surnatante per valutare il rendimento e il dominio rappresentato thylakoid (sub), rispettivamente, della frazione solubilizzata. Il rapporto di clorofilla a/b in tilacoidi intatto di crescita-luce acclimatati piante è in genere intorno alle 3, mentre il chl un / valore b di thylakoid frazioni arricchite in grana o stroma tilacoidi scende di sotto (~ 2,5) o superiore (~ 4,5) al valore del totale tilacoidi, rispettivamente.

Per fornire la carica negativa per i complessi di proteine, colorante (CBB) azzurro brillante di Coomassie è aggiunto al campione solubilizzato. A causa dello spostamento di carica, complessi proteici migrano verso l'anodo e sono separati su una pendenza di acrilamide (AA) secondo la loro forma e la massa molecolare. Separazione efficace e ad alta risoluzione si ottiene utilizzando un gradiente di concentrazione di acrilammide lineare. Durante l'elettroforesi, i complessi di proteine migrano verso l'anodo fino a quando essi raggiungono il loro limite di dimensione dei pori dipendente dalla dimensione. Il formato del poro del gel di poliacrilammide dipende da (i) il totale acrilammide /bis- acrilammide concentrazione (T) e (ii) il cross-linker bis- acrilammide monomero concentrazione (C) riguardante i monomeri totale⁴. Dopo la separazione con BN-PAGE, i complessi di proteine possono essere ulteriormente suddivisi in loro subunità proteiche individuali di seconda dimensione (2D) - SDS - PAGE. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l'analisi di complessi di proteine di membrana tilacoide da BN-pagina/2D-SDS-PAGE.

Protocollo

1. preparazione BN Gel^1,2,3

1. Impostare la colata di gel con piastre di 8 x 10 cm (rettangolare in vetro e piastra dentellata allumina) secondo le istruzioni del produttore mediante distanziali di 0,75 mm.
2. Posizionare un gradiente mixer su un piatto di mescolare e collegarlo con la pompa peristaltica di una tubazione. Collegare una siringa a altra estremità del tubo e inserire l'ago tra la piastra di vetro e alluminio. Agitatore magnetico posto il "pesante" (H)-camera.
3. Preparare il 3,5% (v/v) e del 12,5% (v/v) soluzioni di acrilamide (AA) in provette coniche da 15 mL per la sfumatura di gel di separazione (Vedi ricette in tabella 1). Per evitare la polimerizzazione prematura, mantenere le provette da centrifuga sul ghiaccio durante la preparazione delle soluzioni.
   Attenzione: L'acrilammide è neurotossico e cancerogeno, indossare indumenti protettivi e guanti.
4. Aggiungere 5% APS e TEMED diritto prima di pipettaggio le soluzioni al mixer del gradiente. Dispensare la soluzione di 12,5% per la camera-H.
   1. Rimuovere le bolle d'aria dal canale di collegamento tra la "luce" (L) e la H-Camera aprendo la valvola che collega le due camere che permette soluzione entrare alla L-camera. Chiudere la valvola e dispensare che le tracce di soluzione torna alla camera di H.
   2. Infine, dispensare la soluzione di 3,5% per la camera da L.
5. Accendere l'agitatore magnetico (la velocità di stir non è critica, ma esso dovrebbe garantire la corretta miscelazione delle soluzioni pesanti e leggeri), aprire le valvole e accendere la pompa peristaltica. Permettono le soluzioni di gel di fluire tra la piastra di vetro e alluminio, la portata dovrebbe essere di circa 0,5 mL/min. L'ago deve essere sopra il liquido tutto il tempo, può essere collegato alla parte superiore della lastra di vetro con un nastro.
6. Quando le camere H e L sono svuotati, riempirli con acqua ultrapura e permettere all'acqua di delicatamente overlay sulla superficie del gel. La polimerizzazione del gel richiede circa 1-2 ore a TA.
7. Preparare la soluzione di acrilammide 3% (vedi ricetta in tabella 1) per l'impilamento del gel a RT. Dispensare il gel d'impilamento in cima il gel polimerizzato separazione (prima del getto il gel d'impilamento, rimuovere l'acqua sovrapponendo la superficie del gel) e collocare un pettine di gel di campione tra il vetro e alluminio piastra evitando bolle d'aria.
   1. Lasciare per polimerizzare 30-60 min a RT. Remove il pettine delicatamente sotto l'acqua ultrapura. Memorizzare il gel a + 4 ˚ c.
      Punto di pausa. Il gel può essere conservato a + 4 ˚ c per pochi giorni. Il gel dovrebbe essere mantenuto in condizioni di umidità per evitare l'essiccamento dei pozzi e la superficie del gel.

2. Thylakoid solubilizzazione^1,2,3

Nota: Tutte le procedura deve essere eseguita sotto luce molto fioca. Mantenere i campioni e buffer sul ghiaccio.

1. Diluire tilacoidi isolato con gelida 25BTH20G buffer per una concentrazione di clorofilla finale di 1 mg/mL. Per analisi 2D-BN-SDS-PAGE circa 4-8 µ g di clorofilla / campione è adatto.
   Nota: I tilacoidi utilizzati negli esperimenti devono essere isolati dalle foglie fresche (per protocollo di isolamento tilacoide, Vedi³)
2. Aggiungere un volume equivalente di tampone detergente, cioè, 2% β-DM (w/v) o 2% della digitonina (w/v). Mescolare il detersivo per il campione di thylakoid delicatamente con la punta della pipetta ed evitare di fare bolle d'aria. La concentrazione finale del detergente è 1% e quella dei tilacoidi 0,5 mg Chl/mL.
   1. Solubilizzare i tilacoidi per 2 min su ghiaccio (β-DM) o 10 minuti a RT con continua miscelazione delicata su un bilanciere/shaker (digitonina).
      Nota: Digitonina e β-DM sono generalmente utilizzati per la solubilizzazione dei complessi della proteina thylakoid. Se vengono utilizzati altri detergenti non ionici, la concentrazione di detersivo e il tempo di solubilizzazione deve essere ottimizzate prima. Solitamente l'intervallo di concentrazione detergente da 0,5% - 5% (v/v).
      Attenzione: Digitonina è tossica, indossare indumenti protettivi e guanti
3. Rimuovere il materiale insolubilized mediante centrifugazione a 18.000 x g per 20 min, a + 4 ˚ c.
4. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 mL e aggiungere 1/10 (v/v) di buffer di CBB al campione.
   Nota: Quando viene esaminata la composizione dei complessi proteici della membrana tilacoide, determinare il rendimento e il dominio di thylakoid rappresentato della frazione solubilizzata è raccomandato. Per determinare il rendimento del materiale solubilizzato, prendere 5 µ l del surnatante ad un nuovo tubo (prima di aggiungere di CBB) e misurare il contenuto di Chl e Chl un / b rapporto⁵.

3. BN-PAGE^1,2,3

1. Impostare il gel per un sistema di elettroforesi verticale (ad es., Hoefer SE 250). Riempire l'alloggiamento superiore del buffer con il catodo blu tampone (Vedi tabella 1) e versare il buffer di anodo per la camera di buffer inferiore.
2. Caricare un esempio di thylakoid (ad es., 5 µ g di clorofilla) nei pozzetti.
3. Avviare l'elettroforesi e gradualmente aumentare la tensione: 75 V per 30 min, 100 V per 30 min, 125 V per 30 min, 150 V per 1 h e 175 V fino ai complessi sono stati separati completamente. Eseguire il gel a + 4 ° c, utilizzando una cella frigorifera o regolazione della temperatura di gel con un sistema di raffreddamento.
   Nota: Modificare il buffer di catodo blu a un buffer di catodo chiaro quando la parte anteriore del campione ha migrato circa un terzo del gel.
4. Dopo la corsa elettroforetica, scansione il gel con uno scanner per l'archiviazione di immagini.

4. 2D-SDS-PAGE

1. Assemblare il sistema di elettroforesi verticale (dimensioni dei gel 16 cm x 20 cm). Utilizzare distanziatori di 1 mm.
2. Preparare gli standard del gel di SDS (12% di acrilammide, 6 M Urea, vedi ricetta nella tabella 2) con un 2D-pettine (singolo grande bene per la strip e un pozzetto standard per marcatore di peso molecolare).
3. Tagliare la corsia da BN-gel e inserirlo in un tubo (5 mL). Aggiungere 2 mL di tampone di Laemmli (contenente 5% β-mercaptoetanolo) ed incubare la striscia per 45 minuti con agitazione delicata a TA.
4. Posizionare la corsia, con l'aiuto di ad esempio, un distanziatore, sulla superficie del gel, evitando bolle d'aria.
5. Pipettare 5 µ l di marcatore di peso molecolare su un pezzo di carta da filtro e posto la carta per lo standard ben stretto.
6. Per sigillare la striscia BN-gel e la carta di marcatore, versare 0,5% di agarosio (in tampone di corsa) sopra la striscia di gel e lasciare solidificare.
7. Eseguire l'elettroforesi secondo protocolli standard. Dopo l'esecuzione l'elettroforetica, visualizzare le proteine con ad es., macchia Sypro Ruby o macchiatura secondo⁶d'argento.

Risultati

Un sistema rappresentativo di 2D-BN/SDS-PAGE nella Figura 1 viene illustrato la separazione della digitonina e complessi della proteina β-DM-solubilizzato thylakoid e loro composizione in subunità della proteina dettagliate. Il modello complesso della proteina di digitonina solubilizzata tilacoidi (gel orizzontale in alto a sinistra sulla cima di Figura 1A) contiene PSII-LHCII-PSI megacomplex, due grandi supercomplessi di PSII-...

Discussione

I macchinari di conversione di energia fotosintetica sono composto da complessi di grande proteina del multisubunit, che sono incorporati nella membrana tilacoide. Questo protocollo descrive un metodo di base per l'analisi dei complessi proteici thylakoid pianta Arabidopsis thaliana con BN-PAGE combinato con 2D-SDS-PAGE. Il protocollo è adatto anche per l'analisi dei complessi della proteina thylakoid da tilacoidi tabacco e spinaci, ma potrebbe richiedere piccoli aggiustamenti.

Per l...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-aminocaproic acid (ACA)	Sigma-Aldrich	A2504
BisTris	Sigma-Aldrich	B4429
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Acrylamide (AA)	Sigma-Aldrich	A9099	Caution: Neurotoxic!
n-dodecyl-β-D-maltoside	Sigma-Aldrich	D4641
Tricine	Sigma-Aldrich	T0377
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
SDS	VWR	442444H
Urea	VWR	28877.292
Glycerol	J.T. Baker	7044
Sodium Fluoride (NaF)	J.T. Baker	3688
EDTA disodium salt	J.T. Baker	1073
Digitonin	Calbiochem	300410	Caution:Toxic!
Pefabloc SC	Roche	11585916001
Serva Coomassie Blue G	Serva	35050
β-mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710
APS (Ammonium persulfate)	Bio-Rad	161-0700
TEMED (Tetramethylethylenediamine)	Bio-Rad	1610801
(N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide	Omnipur	2610
Glycine	Fisher	G0800
Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa)	New England Biolabs	P7708
Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml	Corning	352093
Dual gel caster with 10 x 8 cm plates	Hoefer	SE215
Gradient maker SG5	Hoefer
0.75 mm T-spacers	Hoefer	SE2119T-2-.75
Sample gel comb, 0.75 mm	Hoefer	SE211A-10-.75
Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system	Hoefer	SE250
IPC-pump	Ismatec
Power supply, PowerPac HV	Bio-Rad	164-5097
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Rocker-Shaker	Biosan	BS-010130-AAI
PROTEAN II xi Cell	Bio-Rad	1651813