Extrazellulärer Glukosemangel als indirektes Maß für die Glukoseaufnahme in Zellen und Geweben ex vivo

Zusammenfassung

Die extrazelluläre Erschöpfung von fluoreszenzmarkierter Glukose korreliert mit der Glukoseaufnahme und könnte für das Hochdurchsatz-Screening der Glukoseaufnahme in ausgeschnittenen Organen und Zellkulturen verwendet werden.

Zusammenfassung

Die anhaltende weltweite Diabetes-Epidemie erhöht die Nachfrage nach der Identifizierung von umweltbedingten, ernährungsphysiologischen, endokrinen, genetischen und epigenetischen Faktoren, die die Glukoseaufnahme beeinflussen. Die Messung der intrazellulären Fluoreszenz ist eine weit verbreitete Methode, um die Aufnahme von fluoreszenzmarkierter Glukose (FD-Glukose) in Zellen in vitro zu testen oder um glukoseverbrauchende Gewebe in vivo abzubilden. Dieser Assay bewertet die Glukoseaufnahme zu einem ausgewählten Zeitpunkt. Die intrazelluläre Analyse geht davon aus, dass der Stoffwechsel von FD-Glukose langsamer ist als der von endogener Glukose, die an katabolen und anabolen Reaktionen und Signalen beteiligt ist. Der dynamische Glukosestoffwechsel verändert jedoch auch die Aufnahmemechanismen, was kinetische Messungen der Glukoseaufnahme als Reaktion auf verschiedene Faktoren erfordern würde. Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Messung des extrazellulären FD-Glukose-Abbaus und validiert ihre Korrelation mit der intrazellulären FD-Glukose-Aufnahme in Zellen und Geweben ex vivo. Der extrazelluläre Glukosemangel kann potenziell für kinetische und dosisabhängige Hochdurchsatzstudien sowie für die Identifizierung von Verbindungen mit glykämischer Aktivität und ihren gewebespezifischen Wirkungen geeignet sein.

Einleitung

Die Nachfrage nach der Messung der Glukoseaufnahme steigt zusammen mit der dringenden Notwendigkeit, einen epidemischen Anstieg einer Vielzahl von Krankheiten, die vom Glukosestoffwechsel abhängen, anzugehen. Zugrunde liegende Mechanismen von degenerativen Stoffwechselerkrankungen, neurologischen und kognitiven Störungen¹, entzündlichen 2 und Infektionskrankheiten³, Krebs^4,5 sowie Alterung⁶, hängen vom Glukosestoffwechsel für Energie und deren Speicherung, anabole Prozesse, Protein- und Genmodifikation, Signalisierung, Regulation von Genen und Nukleinsäuresynthese und Replikation ab ^7,8,9 . Diabetes mellitus (DM) steht in direktem Zusammenhang mit einer Fehlfunktion der Regulation der Glukoseaufnahme. DM ist ein Spektrum chronischer Krankheiten wie Typ-1-, -2- und -3-Diabetes mellitus, Schwangerschaftsdiabetes, Altersdiabetes der Jungen und andere Arten dieser Krankheit, die durch Umwelt- und / oder genetische Faktoren induziert werden. Im Jahr 2016 zeigte der erste globale Bericht der WHO über Diabetes, dass sich die Zahl der Erwachsenen, die mit der am weitesten verbreiteten DM leben, seit 1980 auf 422 Millionen Erwachsene fast vervierfacht^{hat 10}, und diese Zahl der DM-Patienten ist in den letzten Jahrzehnten exponentiell gestiegen. Allein im Jahr 2019 wurden schätzungsweise^1,5 Millionen Todesfälle direkt durch 10 DM verursacht. Dieser dramatische Aufschwung ist auf den Anstieg der Typ-2-DM und die Bedingungen zurückzuführen, die sie antreiben, einschließlich Übergewicht und Fettleibigkeit¹⁰. Die COVID-19-Pandemie zeigte einen zweifachen Anstieg der Mortalität bei Patienten mit DM im Vergleich zur Allgemeinbevölkerung, was auf die tiefgreifende, aber wenig verstandene Rolle des Glukosestoffwechsels bei der Immunabwehr^{hindeutet 3.} Prävention, Früherkennung und Behandlung von DM, Fettleibigkeit und anderen Krankheiten erfordern die Optimierung von Messungen der Glukoseaufnahme durch verschiedene Gewebe und die Identifizierung von Umweltfaktoren 11, Ernährung 12, endokrine¹³, genetische¹⁴ und epigenetische ^15, die die Glukoseaufnahme beeinflussen.

In der Forschung wird die intrazelluläre und/oder Gewebeaufnahme von Glukose üblicherweise durch fluoreszenzmarkierte Glukose (FD-Glukose) in vitro 16,17,18 und in vivo ¹⁹ gemessen^. FD-Glucose wurde zu einer bevorzugten Methode im Vergleich zu präziseren Methoden mit radioaktiv markierter Glukose 20, analytischer Massenspektroskopieanalyse 21, Metabolomik 22, Kernspinresonanzmethoden 23 und Positronenemissionstomographie/Computertomographie (PET/CT)^5,24. Im Gegensatz zur Aufnahme von FD-Glukose können analytische Methoden, die mehr biologisches Material erfordern, eine mehrstufige Probenvorbereitung, teure Instrumente und komplexe Datenanalysen umfassen. Effektive und kostengünstige Messungen der FD-Glukoseaufnahme in Zellkulturen wurden in Proof-of-Concept-Experimenten verwendet und erfordern möglicherweise eine Validierung durch andere Methoden.

Die Grundlage der FD-Glukoseanwendung für Glukoseaufnahmestudien ist der reduzierte Metabolismus von FD-Glukose im Vergleich zu endogener Glukose²⁵. Nichtsdestotrotz sind sowohl endogene Glukose als auch FD-Glukose dynamisch auf alle zellulären Kompartimente verteilt, um sie in anabolen, katabolen und Signalprozessen einzusetzen. Die Kompartimentierung und zeitabhängige Verarbeitung²⁵ von FD-Glucose stören die Fluoreszenzmessungen und stellen die wichtigsten limitierenden Faktoren für die Verwendung dieses Assays in Hochdurchsatz-Screening-Experimenten, kinetischen Analysen, 3D-Zellkulturen, Co-Kulturen und Gewebeexplantationsexperimenten dar. Hier liefern wir Daten, die eine hohe Korrelation zwischen dem extrazellulären Abbau von FD-Glukose und seiner intrazellulären Aufnahme zeigen, was auf den extrazellulären Abbau von FD-Glucose als Ersatzmessung für die intrazelluläre Glukoseaufnahme hindeutet. Die Messung des extrazellulären Erschöpfungs von Glukose wurde angewendet, um gewebespezifische Unterschiede in der Glukoseaufnahme bei Mäusen, die mit Insulin behandelt wurden, und einem experimentellen Medikament¹⁸ zu validieren, um einen Proof-of-Principle dieser Methode zu liefern.

Das aktuelle Protokoll beschreibt intrazelluläre und extrazelluläre (Abbildung 1) Messungen der FD-Glukoseaufnahme in 3T3-L1-Zellen. Protokollabschnitte 1-7 erklären die Kultur und das Wachstum von Zellen für 48 h; Zellhunger, Stimulation und extrazelluläre Basismessungen; und Poststimulationsmessungen von extrazellulärer FD-Glucose und intrazellulären Messungen von FD-Glucose und Protein. Protokollabschnitt 8 beschreibt die Ex-vivo-Messung der extrazellulären Aufnahme von FD-Glucose in Geweben, die von ob /ob-Mäusen in Gegenwart und Abwesenheit von Insulin und Aminosäureverbindung 2 (AAC2) seziert wurden, wie an anderer Stelle¹⁸ beschrieben.

Protokoll

Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Ohio State University (OSU, Protokoll 2007A0262-R4) genehmigt.

HINWEIS: Alle Verfahren müssen in einer Biosicherheitskabine der Klasse II mit eingeschaltetem Gebläse und ausgeschaltetem Licht durchgeführt werden.

1. Vorbereitung der Materialien

HINWEIS: Alle Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Herstellung von Medium 1, Zentrifugationsmedium 2 und Lager- und Arbeitslösungen von fluoreszierender 2-Desoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl)-amino]-D-glucose (2-NBDG oder FD-Glucose) gemäß Tabelle 1 in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II. Schützen Sie FD-Glukose während des gesamten Experiments vor Licht, indem Sie alle Lichter unter der Haube ausschalten.
2. Verwenden Sie gebrauchsfertige Zellkulturreagenzien: Trypsin-EDTA, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und glukosefreies und phenolrotfreies Dulbecco's Modified Eagle Medium (im Folgenden glukosefreies DMEM).
3. Verwenden Sie 20 ml RIPA-Lysepuffer (Radioimmunprecipitation Assay).
   HINWEIS: In den folgenden Abschnitten werden extrazelluläre Depletion und intrazelluläre Aufnahme verschiedener FD-Glukosedosen in 3T3-L1-Fibroblasten mit und ohne Insulinstimulation verglichen (Abbildung 2).

2. 3T3-L1 Zellkultur und Wartung

1. Kultur 3T3-L1 Maus-Fibroblasten durch Beschichtung von 1 x 10⁶ Zellen, verdünnt in 20 ml Medium 1 in zwei 96-Well-Platten. Platte 100 μL Zellsuspension pro Well, um sicherzustellen, dass die Homogenität dieser Suspension durch Mischen erhalten bleibt. Züchten Sie Zellen für 48 h in einem 37 °C Inkubator (5% CO₂ und 95% Luftfeuchtigkeit) ohne Medienwechsel bis etwa 70% -80% Zusammenfluss.
2. Halten Sie die Zellen zusammenfließend und nüchtern, indem Sie sie 48 h lang im selben Medium kultivieren. Variieren Sie die Inkubationszeit von 24-72 h je nach gewünschtem katabolen Fastenzustand.

3. Verhungern von 3T3-L1-Zellen

1. Dekantieren Sie Medien aus Zellen in den 96-Well-Platten. Nehmen Sie die restliche Flüssigkeit mit sterilen Papiertüchern auf.
2. Spülen Sie die 96-Well-Platte mit 100 μL PBS pro Well ab und absorbieren Sie die restliche Flüssigkeit mit sterilen Papiertüchern.
3. 100 μL glucosefreies DMEM pro Bohrung hinzufügen und 40 min inkubieren. Passen Sie den Zeitpunkt der Inkubation in Abhängigkeit von Zelltyp, Reizen und gewünschtem Fastengrad an.
   HINWEIS: Der Zeitpunkt der Inkubation kann je nach Jahreszeit optimiert werden.

4. Herstellung von FD-Glucose-Lösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen

HINWEIS: Das Experiment in Abbildung 2 untersucht extrazelluläre und interzelluläre Medien mit und ohne Stimulation mit Insulin.

1. Verwenden Sie acht Replikate (eine Reihe in einer 96-Well-Platte) für jede Stimulationsbedingung. Bereiten Sie daher 1 ml für jede Stimulationsbedingung vor (siehe Tabelle 2 und unten).
2. Verwenden Sie acht Stimulationsbedingungen ohne Insulin: FD-Glukose von 2,5 μg / ml, 1 μg / ml, 0,5 μg / ml, 0,2 μg / ml, 0,1 μg / ml, 0,05 μg / ml und 0 μg / ml (Kontrolle ohne FD-Glukose) in einer 96-Well-Platte.
3. Verwenden Sie acht Stimulationsbedingungen mit Insulin (10 μg / ml, Endkonzentration): FD-Glukose von 2,5 μg / ml, 1 μg / ml, 0,5 μg / ml, 0,2 μg / ml, 0,1 μg / ml, 0,05 μg / ml und 0 μg / ml (Kontrolle ohne FD-Glukose) in einer weiteren 96-Well-Platte.
4. Zur Vorbereitung der Stimulationsbedingungen verdünnen Sie 1 μL 5 mg/ml FD-Glucose-Arbeitslösung (Tabelle 1) in 999 μL glukosefreiem DMEM, um 1 ml Arbeitsmateriallösung (1:1000 Verdünnung oder 5 μg/ml) zu erhalten.
   1. Bereiten Sie mit dieser Arbeitsstofflösung 1:2000, 1:5000, 1:10.000, 1:25.000, 1:50.000 und 1:100.000 Verdünnungen von FD-Glucose vor, um 2,5 μg/ml, 1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 0,2 μg/ml, 0,1 μg/ml und 0,05 μg/ml (Tabelle 2) in 2 ml-Röhrchen unmittelbar vor Experimenten in einer Biosicherheitswerkbank ohne Licht zu erhalten.
5. Wiederholen Sie Schritt 4.4 und fügen Sie 1 μl Insulin (10 mg/ml, Endkonzentration) zu jeder der oben genannten Bedingungen hinzu.
   HINWEIS: Die endgültige Insulinkonzentration in diesen Proben beträgt 10 μg/ml = 1,7 nmol/ml. Um eine Homogenisierung zu erreichen, fügen Sie Insulin zu den Röhrchen hinzu, bevor Sie andere Lösungen hinzufügen.

5. Behandlung von verhungerten 3T3-L1-Zellen

1. Dekantieren Sie nach 40 Minuten Inkubation das glukosefreie DMEM aus jedem Bohrloch in 96-Well-Platten und absorbieren Sie die restliche Flüssigkeit mit sterilen Papiertüchern.
2. Fügen Sie jeweils 100 μL (pro Well) aus den verschiedenen oben beschriebenen Behandlungsbedingungen zu Bohrlöchern entlang einer Spalte hinzu und 100 μL (pro Well) von der gleichen Behandlungsbedingung zu den Wells entlang der Reihe (acht Replikate) in beiden 96-Well-Platten. Beschriften Sie die Platten, die die Bedingungen mit und ohne Insulin verwendet haben. Fügen Sie den Kontrollquellen (n = 8) allein glukosefreies DMEM hinzu.
3. Inkubieren Sie die Platte für 40 min in einem Zellkultur-Inkubator (37 ° C, 5% CO₂ und 95% Luftfeuchtigkeit) im Dunkeln.

6. Extrazelluläre und interzelluläre Messungen für stimulierte 3T3-L1-Zellen

1. Nachdem die Zellen für 40 min stimuliert wurden, übertragen Sie die Stimulationsmedien von beiden Platten in neue 96-Well-Platten, die das gleiche experimentelle Layout beibehalten.
2. Dekantieren Sie die verbleibende Lösung aus den ursprünglich stimulierten 96-Well-Platten mit Zellen auf sterilen Papiertüchern.
3. Optional Zellen mit PBS waschen. Entfernen Sie PBS und dekantieren Sie die verbleibende Lösung auf sterile Papiertücher.
4. Fügen Sie 100 μL des RIPA-Lysepuffers zu jeder Vertiefung hinzu. Fügen Sie optional Proteasehemmer zum RIPA-Puffer hinzu, um Proteine zu schützen. Legen Sie Platten mit RIPA für 30 min in einen Shaker.
5. Messen Sie mit einem Mikroplattenleser (Table of Materials) die Fluoreszenz bei Anregungs- (Ex) und Emissionswellenlängen (Em) von 485 bzw. 535 nm, zuerst in dem Medium, das extrazelluläre FD-Glukose enthält, und dann die Platte mit RIPA-lysierten Zellen am Ende der 30-minütigen Inkubation (siehe Schritt 6.4).

7. Proteinbasierte Normalisierung der intrazellulären Glukoseaufnahme

HINWEIS: Die intrazelluläre FD-Glukoseaufnahme hängt von der Zellzahl ab. Die Proteinspiegel in zellulären Lysaten sind proportional zu den Zellzahlen, die es ermöglichen, den intrazellulären FD-Glukosespiegel auf die Anzahl der Zellen in jedem Brunnen zu normalisieren.

1. Führen Sie den BCA-Proteinassay gemäß den Anweisungen des Herstellers durch (siehe Materialtabelle). Quantifizieren Sie die Proteinkonzentrationen in jedem Bohrloch, das RIPA-lysierte Zellen enthält.
2. Verwenden Sie 10 μL des RIPA-Homogenats und messen Sie Proteinkonzentrationen in dreifacher Reihenfolge, um die Genauigkeit der Messungen in 96-Well-Platten zu erhöhen.
3. Quantifizieren Sie das Protein basierend auf Proteinstandards (0, 10, 20, 30, 40, 50 und 60 μg / ml-Protein), die zusammen mit Proben auf jeder 96-Well-Platte analysiert werden.
4. Messen Sie die Absorption bei 562 nm und quantifizieren Sie die Proteinkonzentrationen in jeder Probe basierend auf der linearen Regressionsformel, die für den Proteinstandard erhalten wurde.
5. Normalisieren Sie den Gehalt an intrazellulärer FD-Glukose, indem Sie den Fluoreszenzwert / die Proteinkonzentration in jedem Brunnen verwenden. Der extrazelluläre FD-Glukose-Abbau erfordert keine Normalisierung.
6. Optional können Sie die durchschnittlichen Basiswerte in Kontrollstichproben für eine zusätzliche Normalisierung (100 %) verwenden.

8. Ex-vivo-Messung des extrazellulären FD-Glukosemangels in Organen

1. Behandeln Sie Mäuse mit Verbindungen, die den Glukosestoffwechsel vor der Organdissektion stimulieren, wie folgt.
2. Verwenden Sie neun Wochen alte männliche Lep-ob-Mäuse (n = 11). Füttern Sie alle Mäuse vor dem Experiment mit einer regelmäßigen Chow-Diät.
3. Weisen Sie Mäuse nach dem Zufallsprinzip in drei Gruppen für intraperitoneale (i.p.) Injektionen ein.
   1. Injizieren Sie Mäuse aus der Kontrollgruppe Lep^ob mit 0,1 ml sterilem PBS (n = 4).
   2. Injizieren Sie Mäusen aus der Insulin-Lep-ob-Gruppe 0,1 ml steriles PBS, das 12 IE Humaninsulin pro Gramm Körpergewicht (BW) enthält (n = 3).
   3. Injizieren Sie Mäuse aus der AAC2 Lep^ob-Gruppe mit 0,1 ml sterilem PBS, das 0,1 nmol AAC2 pro Gramm Körpergewicht (BW) (n = 4) enthält.
4. Nach 15 min inhalieren Mäuse 5% Isofluran und Exsanguinatblut durch Herzpunktion von den betäubten Tieren²⁶.
5. Sezieren Sie viszerales epidydimales weißes Fettgewebe (200 mg), Leber (200 mg) und das ganze Gehirn von jedem Tier. Verwenden Sie eine Biosicherheitshaube der Klasse II für die Handhabung von Geweben.
6. Bereiten Sie FD-Glucose (0,29 mM) Arbeitslösung in glukosefreiem DMEM in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II ohne Licht vor.
7. Messen Sie die Fluoreszenz der FD-Glucose-Arbeitslösung (0,29 mM) bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 485 bzw. 535 nm mit einem Mikroplattenleser.
8. Inkubieren Sie die entnommenen Gewebe / Organe in einer 6-Well-Platte, die PBS enthält, für 1 min. Behandeln Sie jedes Gewebe oder Organ in einem separaten Brunnen.
9. Nach 1 Minute legen Sie jedes Taschentuch auf ein steriles Papiertuch, um PBS zu absorbieren. Gewebe/Organe in eine separate 6-Well-Platte mit 4.000 μL glucosefreiem DMEM überführen und 2 min inkubieren.
10. Nach 2 min entfernen und übertragen Sie das Gewebe in Vertiefungen einer 6-Well-Platte, die 0,29 mM FD-Glukose-Arbeitslösung (1 ml/Well) enthält. Inkubieren Sie die 6-Well-Platten, die Gewebe enthalten, in FD-Glucose-Arbeitslösung bei 37 ° C (5% CO 2 und 95% Luftfeuchtigkeit_).
11. Sammeln Sie 100 μL FD-Glukose-Arbeitslösung aus jedem Bohrloch nach 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 und 120 Minuten Inkubation, um die Kinetik der extrazellulären FD-Glukoseerschöpfung zu analysieren. Vor und nach dem Sammeln schütteln.
12. Übertragen Sie 100 μL FD-Glucose-Arbeitslösung in 96-Well-Platten, um die Fluoreszenz bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 485 bzw. 535 nm mit einem Mikroplattenleser zu messen.
13. Normalisieren Sie die Fluoreszenz auf den 0-Minuten-Wert (100%) für jedes Organ in jedem Tier (Abbildung 3).

Ergebnisse

Die intrazelluläre Aufnahme und der extrazelluläre Glukosemangel wurden in 3T3-L1-Präadipozyten als Reaktion auf unterschiedliche Konzentrationen von FD-Glucose (Abbildung 2) mit und ohne Insulinstimulation gemessen. Abbildung 2A zeigt eine dosisabhängige Erhöhung der intrazellulären Aufnahme von FD-Glukose, die in Gegenwart von Insulin signifikant erhöht war. Die gleichzeitige Abnahme der extrazellulären FD-Glukose in denselben Zellen ist in

Diskussion

Der direkte Vergleich der extrazellulären FD-Glukose-Depletion mit der normalisierten intrazellulären Glukoseaufnahme in der Zellkultur zeigte eine hohe Korrelation, was darauf hindeutet, dass der extrazelluläre Glukosemangel eine Ersatzmessung für die Beurteilung der Glukoseaufnahme sein könnte. Die Messung von extrazellulärer FD-Glukose kann einen breiten Bereich von FD-Glukosekonzentrationen verwenden, auch 0,5-2,5 μg FD-Glukose / ml scheinen den optimalen Bereich zu liefern. Extrazelluläre FD-Glukose erforder...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3T3-L1 mouse fibroblasts	ATCC	CL-173	Cell line
96-well plates	Falcon	353227	Plastic ware
B6.V-Lepob/J male mice	Jackson Laboratory	stock number 000632	Mice
BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US)	Fisher Scientific, US	B-SHT	Device
Bovine serum	Gibco/ThermoFisher	161790-060	Cell culture
Calf serum	Gibco/ThermoFisher	26010-066	Cell culture
Cell incubator	Forma	Series II Water Jacket	Device
Diet (mouse/rat diet, irradiated)	Envigo	Teklad LM-485	Diet
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma LifeScience	D2650-100mL	Reagent
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco/ThermoFisher	11965-092	Cell culture
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023-500mL	Reagent
Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose)	Sigma	72987-1MG	Assay
Glucose-free and phenol red-free DMEM	Gibco/ThermoFisher	A14430-01	Cell culture
Human insulin 10 mg/mL	MilliporeSigma, Cat N 91077C	Cat N 91077C	Reagent
Isoflurane, 5%	Henry Schein	NDC 11695-6776-2	Anestaetic
Penicillin/streptomycin (P/S)	Gibco/ThermoFisher	15140-122	Cell culture
Phosphate buffered solution	Sigma-Aldrich	DA537-500 mL	Cell culture
Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay	ThermoFisher	Cat N23225	Assay
Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer	Santa Cruz Biotechnology	sc-24948	Assay
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco/ThermoFisher	25300-054	Cell culture