단세포 물질 특성 측정을 위한 전단 분석 프로토콜

요약

이 프로토콜은 시험관 내에서 암성 및 비암성 세포주의 기계적 특성의 정량화를 설명합니다. 암세포와 정상 세포의 역학에서 보존된 차이는 예후와 진단에 영향을 미칠 수 있는 바이오마커로 작용할 수 있습니다.

초록

불규칙한 생체 역학은 광범위한 연구 대상인 암 생물학의 특징입니다. 셀의 기계적 특성은 재료의 기계적 특성과 유사합니다. 스트레스와 긴장에 대한 세포의 저항력, 이완 시간 및 탄력성은 모두 다른 유형의 세포와 비교하고 도출할 수 있는 특성입니다. 암성(악성) 세포와 정상(비악성) 세포의 기계적 특성을 정량화함으로써 연구자들은 이 질병의 생물물리학적 기초를 추가로 밝힐 수 있습니다. 암세포의 기계적 특성은 정상 세포의 기계적 특성과 일관되게 다른 것으로 알려져 있지만, 배양 중인 세포로부터 이러한 특성을 추론하는 표준 실험 절차는 부족합니다.

이 논문은 유체 전단 분석을 사용하여 시험관 내에서 단일 세포의 기계적 특성을 정량화하는 절차를 간략하게 설명합니다. 이 분석의 원리는 단일 세포에 유체 전단 응력을 적용하고 시간 경과에 따른 세포 변형을 광학적으로 모니터링하는 것입니다. 세포 기계적 특성은 디지털 이미지 상관 관계 (DIC) 분석을 사용하고 DIC 분석에서 생성 된 실험 데이터에 적절한 점탄성 모델을 맞추는 데 사용됩니다. 전반적으로, 여기에 요약된 프로토콜은 치료하기 어려운 암의 진단을 위한 보다 효과적이고 표적화된 방법을 제공하는 것을 목표로 합니다.

서문

암성 세포와 비암성 세포 간의 생물물리학적 차이를 연구하면 새로운 진단 및 치료 기회를 얻을 수 있습니다¹. 생체역학/기계생물학의 차이가 종양 진행 및 치료 저항성에 어떻게 기여하는지 이해하면 표적 치료 및 조기 진단을 위한 새로운 길을 제시할 수 있습니다².

암세포의 기계적 성질이 정상 세포와 다르다는 것은 알려져 있지만(예를 들어, 원형질막과 핵막의 점^{탄성)3,4,5,} 살아있는 세포에서 이러한 성질을 측정하기 위한 견고하고 재현 가능한 방법은 부족하다⁶. 전단 분석 방법은 단일 세포에 유체 전단 응력을 가하고 적용된 응력 3,4,5,7,8,9에 대한 개별 반응 및 저항을 분석하여 세포의 기계적 특성을 정량화하는 데 사용됩니다.

프로토콜

1. 단세포 전단 분석을 위한 준비

1. 세포 배양
   1. 2mL의 배양 배지가 들어 있는 35mm x 10mm 페트리 접시에 약 50,000개의 현탁 단일 세포를 시딩합니다.
      참고: 파종 전에 부유 세포를 소용돌이쳐 세포 응집체를 분해합니다.
   2. 세포를 37°C에서 배양하고 세포 부착 및 완전한 세포골격 단백질 형성을 위해 10 내지 48시간 사이를 허용한다.
      참고: 세포 응집을 피하면서 적절한 세포 성장과 부착을 보장하기 위해 세포 부착 기간과 증식 및 성장 속도를 고려하십시오. 이러한 매개 변수는 셀 유형에 따라 다릅니다.

2. 전단 분석 실험

1. 전단 분석 점성 유동 매체의 제조
   1. 약간 점성이 있는 유동 배지(0.015-0.02 Pa·s)를 보장하기 위해 0.05wt%의 무독성 및 비알레르기성 메틸셀룰로오스(4Pa·s)를 측정하여 배양 배지에 추가합니다.
   2. 균일한 혼합을 보장하기 위해 마그네틱 교반기/핫 플레이트를 사용하여 ~60-70°C의 온도에서 기본 배양 배지를 ~10-20분 동안 예열합니다. 매체를 계속 교반하면서 메틸셀룰로오스 입자의 응고를 피하기 ....

결과

DIC 및 점탄성 모델을 사용한 변형 분석과 결합된 전단 분석 프로토콜은 시험관 내에서 단일 세포의 기계적 특성을 정량화하는 데 성공적입니다. 이 방법은 정상 인간 유방 세포(MCF-10A)^3,4,9, 전이성이 적은 삼중 음성 유방암 세포(MDA-MB-468)3, 삼중 음성 유방암 세포(MDA-MB-231)3, 인간 골육종 세포 ^7,8, 그리고 가장 최근에는 교?.......

토론

세포와 주변의 기계적 미세 환경 및 기계적 응력에 대한 반응을 시뮬레이션하기 위해 유사 기계 생물학적 환경을 설정하는 것을 포함하는 전단 분석 방법은 세포 기계적 특성 카탈로그를 생성했으며, 그 패턴은 암 세포주 3,4,5,7,8 사이에서 보존 된 물리적 이형성을 보여줍니다

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
CELL CULTURE
.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate	Corning	25-053-ci	For cellular detachment from substrate in cell culture
15 mL centrifuge tubes	Falcon by Corning	05-527-90
35 mm Petri dishes	Corning	430165
50 mL centrifuge tubes	Falcon by Corning	14-432-22
centrifuge	any		For sterile cell culture
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x	Corning	10-013-cv	Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells
gloves	any		For sterile cell culture
Heracell Vios 160i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51033770	For Incubation during cell culture
Hood	any		For sterile cell culture
micropipette	any		For sterile cell culture
micropipette tips	any		For sterile cell culture
Microscope	Leica/any		For sterile cell culture
Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x	Corning	21-040-CM
pipetman	any		For sterile cell culture
pipette tips	any		For sterile cell culture
Precision GP 10 liquid incubator	Thermo Scientific	TSGP02
T25 flask	Corning	430639
T75 flask	Corning	430641U
SHEAR ASSAY
100 mL beaker	any		For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
DMEM	Corning
Flow chamber + rubber gasket	Glycotech	31-001	Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes)
Hybrid Rheometer	HR-2 Discovery Hybrid Rheometer		For determination of shear fluid viscosity
magnetic stir bar	any		For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
magnetic stir plate	any		For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
methyl cellulose	any		To increase viscosity of DMEM in flow media
Syringe Pump	KD Scientific Geminin 88 plus	788088	For programming fluid infusion and withdrawal
syringes, tubing, and connectors			For shear apparatus setup
SOFTWARE
ABAQUS software	Simulia
Digitial Image Correlation software	LaVision, Germany	DAVIS 10.1.2
Imaging software	Leica/any microscope software
MATLAB	MATLAB	MATLAB_R2020B