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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo delinea l'utilizzo della trasformazione mediata da Agrobacterium tumefaciens (AMT) per l'integrazione di geni di interesse nel genoma nucleare della microalga verde Chlorella vulgaris, portando alla produzione di trasformanti stabili.

Abstract

La trasformazione mediata dall'Agrobacterium tumefaciens (AMT) funge da strumento ampiamente utilizzato per manipolare i genomi delle piante. Tuttavia, A. tumefaciens mostra la capacità di trasferimento genico a una vasta gamma di specie. Numerose specie di microalghe non dispongono di metodi consolidati per integrare in modo affidabile i geni di interesse nel loro genoma nucleare. Per sfruttare i potenziali benefici della biotecnologia delle microalghe, sono fondamentali strumenti di manipolazione del genoma semplici ed efficienti. In questo articolo, viene presentato un protocollo AMT ottimizzato per la specie di microalghe industriali Chlorella vulgaris, utilizzando la proteina fluorescente verde reporter (mGFP5) e il marcatore di resistenza agli antibiotici per l'igromicina B. I mutanti sono selezionati attraverso la placcatura su terreni Tris-Acetato-Fosfato (TAP) contenenti igromicina B e cefotaxima. L'espressione di mGFP5 è quantificata tramite fluorescenza dopo oltre dieci generazioni di subcoltura, indicando la trasformazione stabile della cassetta T-DNA. Questo protocollo consente la generazione affidabile di più colonie transgeniche di C. vulgaris in meno di due settimane, impiegando il vettore di espressione vegetale pCAMBIA1302 disponibile in commercio.

Introduzione

L'Agrobacterium tumefaciens, un batterio gram-negativo trasmesso dal suolo, possiede una capacità unica di trasferimento genico tra regni, che gli è valsa il titolo di "ingegnere genetico naturale"1. Questo batterio può trasferire il DNA (T-DNA) da un plasmide che induce il tumore (Ti-Plasmide) nelle cellule ospiti attraverso un sistema di secrezione di tipo IV, con conseguente integrazione ed espressione del T-DNA all'interno del genoma ospite 1,2,3,4. Nell'ambiente naturale, questo processo porta alla formazione di tumori nelle piante, comunemente noti come malattia della galla della corona. Tuttavia, l'Agrobacterium può anche trasferire il T-DNA in vari altri organismi, tra cui lieviti, funghi, alghe, embrioni di ricci di mare e persino cellule umane in condizioni di laboratorio 5,6,7,8.

Sfruttando questo sistema naturale, la trasformazione mediata da Agrobacterium tumefaciens (AMT) consente l'integrazione casuale di geni di interesse nel genoma nucleare di una cellula ospite modificando la regione T-DNA del plasmide Ti. A questo scopo, un vettore di espressione delle piante AMT ampiamente utilizzato è pCAMBIA13029. I ricercatori possono utilizzare semplici flussi di lavoro di clonazione in E. coli prima di trasferire il vettore desiderato in A. tumefaciens per il successivo trasferimento all'ospite di interesse.

Le microalghe verdi sono eucarioti che condividono molte somiglianze con le piante terrestri, ma sono altamente recalcitranti alla modificazione genetica. Tuttavia, la trasformazione genetica svolge un ruolo cruciale sia nella ricerca di base che in quella biotecnologica delle microalghe. In diverse specie di microalghe, in particolare Chlamydomonas reinhardtii, la trasformazione genetica tramite AMT ha introdotto con successo transgeni come l'interleuchina-2 umana (hIL-2), il dominio legante il recettore 2 del coronavirus 2 della sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV-2 RBD) e due peptidi antimicrobici (AMP)10,11,12,13. Tra queste, la Chlorella vulgaris, una specie di alga verde meno esigente e a crescita rapida, ha un potenziale significativo per la produzione sostenibile di carboidrati, proteine, nutraceutici, pigmenti e altri composti di alto valore14. Tuttavia, la mancanza di strumenti affidabili per la creazione di ceppi transgenici di C. vulgaris ostacola il suo progresso commerciale. Poiché è stato pubblicato solo un numero limitato di lavori che utilizzano AMT in C. vulgaris15, e date le notevoli differenze tra la coltivazione di piante e microalghe, l'ottimizzazione del protocollo AMT diventa essenziale.

In questo studio, i ricercatori hanno inserito la proteina fluorescente verde (mGFP5) a valle del promotore 35S del virus del mosaico del cavolfiore (CamV) e hanno aggiunto un tag di istidina per utilizzarlo come gene reporter per l'espressione proteica. I trasformanti sono stati selezionati utilizzando l'igromicina B e, dopo la subcoltura per oltre venti generazioni, la trasformazione è rimasta stabile. Il plasmide pCAMBIA1302 impiegato in questo lavoro può essere facilmente adattato per contenere qualsiasi gene di interesse. Inoltre, il metodo e i materiali presentati possono essere adattati per altre specie di alghe verdi con un promotore attivo CamV35S, poiché questo promotore viene utilizzato per la selezione dell'igromicina.

Protocollo

Tutti i terreni e le soluzioni devono essere sterilizzati in autoclave prima dell'uso, salvo diversa indicazione. Tutte le provette da centrifuga, i puntali delle pipette, ecc., devono essere sterili o sterilizzati in autoclave prima dell'uso. Per una facile consultazione, le ricette dei terreni utilizzati in questo protocollo sono elencate nella Tabella 1.

1. Preparazione di cellule elettrocompetenti di A. tumefaciens

  1. Inoculare Agrobacterium (AGL-1) in un matraccio sterile da 25 mL di terreno LB (integrato con rifampicina, 20 mg/L-1) da una scorta di glicerolo congelato e far crescere per una notte a 28-30 °C e 150 giri/min.
    NOTA: Il ceppo di Agrobacterium AGL-1 è (vedi Tabella dei materiali) resistente alla rifampicina, all'ampicillina, al cloramfenicolo e alla streptomicina e può essere ottenuto da diversi fornitori.
  2. Il giorno seguente, diluire la coltura di 1.00.000 volte aggiungendo 0,5 μL di coltura notturna a 50 mL di acqua ultrapura sterilizzata in autoclave e spargere 10 μL di questa coltura diluita su una piastra LB, quindi incubare a 28-30 °C per 1-3 giorni.
  3. Prelevare una colonia e iniziare una coltura notturna da 20 mL in LB con rifampicina a 28-30 °C.
  4. Il giorno successivo, inoculare 500 mL di terreno LB (senza antibiotico) in un matraccio con 9 mL di coltura notturna e far crescere a 28-30 °C fino a quando l'OD600 raggiunge 0,5.
  5. Dividere uniformemente la coltura in dieci provette da centrifuga da 50 ml e raffreddare su ghiaccio per 30 minuti. Preraffreddare la centrifuga a 4 °C.
  6. Centrifugare le provette a 4 °C e 4000 x g per 15 min. Successivamente, rimuovere quanto più surnatante possibile utilizzando una pipetta e risospendere il pellet in ciascuna provetta in 50 mL di acqua ghiacciata.
  7. Centrifugare le cellule a 4 °C e 4000 x g per 15 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 25 mL di acqua ghiacciata in ogni provetta.
  8. Centrifugare le cellule a 4 °C e 4000 x g per 15 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di glicerolo ghiacciato al 10% (p/v) in ciascuna provetta.
  9. Unire tutte le provette in un'unica provetta da 50 mL e centrifugare le cellule a 4 °C e 4000 x g per 15 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 400 μL di glicerolo ghiacciato al 10% (p/v). La concentrazione cellulare dovrebbe essere di circa 1-3 x 1010 cellule/mL.
  10. Distribuire le cellule come aliquote da 50 μL in microprovette sterili preraffreddate. Congelare in azoto liquido e conservare in congelatore a -80 °C.

2. Elettroporazione di A. tumefaciens

  1. Aggiungere 50 μL di celle elettrocompetenti AGL-1 A. tumefaciens in una cuvetta preraffreddata da 0,1 mm e aggiungere 2 μL di pCAMBIA1302 o plasmide simile (conc 15 ng/μL) (vedere la tabella dei materiali).
  2. Elettroporare a 2400 V utilizzando un elettroporatore (200 Ω, estensore di capacità 250 μFD, capacità 25 μFD, decadimento esponenziale, vedi Tabella dei materiali). La costante di tempo dovrebbe essere >4,5 ms per un'elettroporazione di successo con decadimento esponenziale.
  3. Aggiungere immediatamente 1 mL di terreno LB alla cuvetta e pipettare delicatamente su e giù per mescolare. Trasferire 1 mL di cellule risospese in una microprovetta da 1,5 mL e incubarla a 28-30 °C per almeno 1 ora per recuperare.
  4. Placcare le cellule su LB agar contenente l'antibiotico appropriato (cioè 50 mg/L di kanamicina per pCAMBIA1302 per la selezione procariotica).
  5. Incubare a 28-30 °C per 2-3 giorni.
  6. Selezionare una colonia, coltivare per una notte in LB con la selezione appropriata (50 mg/L di kanamicina per pCAMBIA1302) e crioconservare il ceppo contenente plasmidi utilizzando glicerolo al 50% a -80 °C per un uso futuro.

3. AMT di C. vulgaris

NOTA: Preparare le colture di C. vulgaris (UTEX 395, vedi Tabella dei materiali) e A. tumefaciens in parallelo per la co-coltivazione. Le colture di C. vulgaridevono essere iniziate 3 giorni prima di preparare le colture di A. tumefaciens. Il protocollo è stato modificato sulla base di quello pubblicato da Kumar et al.7.

  1. Preparare la coltura di C. vulgaris
    1. C. vulgaris è tradizionalmente conservato in pendenza o mantenuto in colture in fase logaritmica in condizioni di illuminazione. Da una coltura in fase logaritmica a OD600 = 1,0, distribuire 0,5 mL su piastre di agar tris-acetato-fosfato (TAP, vedere tabella 1) ( 1,2% p/v agar A) e far crescere per 5 giorni a 25 °C con illuminazione (50 μE/m2s). In questo modo si otterranno circa 5 x 106 celle.
  2. Preparare la coltura di A. tumefaciens
    1. Coltivare il ceppo A. tumefaciens AGL-1 pCAMBIA1302 in un pallone agitatore inoculando 10 mL di terreno LB integrato con 15 mM di glucosio, 20 mg/L di rifampicina e 50 mg/L di kanamicina (vedi Tabella dei materiali) utilizzando la scorta di glicerolo. Incubare a 28-30 °C e 250 rpm per una notte.
    2. Inoculare 1 mL di coltura notturna in 50 mL di LB con 15 mM di glucosio, 20 mg/L di rifampicina e 50 mg/L di kanamicina e incubare a 28-30 °C e 250 rpm fino a quando l'OD600 raggiunge 1,0.
  3. Cocoltivare C. vulgaris e A. tumefaciens
    1. Per preparare la coltura di A. tumefaciens per la co-coltivazione, trasferire la coltura coltivata in una provetta da 50 ml e centrifugare a 4000 x g per 30 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta e lavare le cellule due volte con il mezzo di induzione.
      NOTA: Il terreno di induzione utilizzato è un terreno TAP regolato a pH 5,5 e integrato con metalli in tracce e vitamine F/2 con acetosiringone da 200 μM (AS, vedere la tabella dei materiali). Risospendere le cellule in un terreno di induzione in modo tale che OD600 = 0,5.
    2. Per preparare la coltura di C. vulgaris per la co-coltivazione, aggiungere 25 mL di terreno di induzione alla piastra di C. vulgaris contenente ~ 5 x 106 cellule. Trasferire in una provetta da 50 ml. Centrifugare le cellule a 4000 x g per 15 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante.
    3. Miscelare il pellet di cellule algali con 200 μL di sospensione batterica (OD600: 0,5) e incubarli in un agitatore rotante a 21-25 °C a 150 giri/min per 1 ora.
    4. Distribuire la coltura mista (200 μL) su piastre di terreno di induzione integrate con glucosio 15 mM e incubare a 21-25 °C al buio per 3 giorni.
    5. Dopo 3 giorni, utilizzare 10 mL di terreno TAP integrato con 400 mg/L di cefotaxima o 20 mg/L di tetraciclina (vedi Tabella dei Materiali) per raccogliere le microalghe e incubare al buio a 21-25 °C per 2 giorni per eliminare A. tumefaciens dalla coltura.
    6. Piastra 500 μL della coltura su terreni selettivi, ad es. terreni TAP integrati con 20-70 mg/L di Igromicina B (quando si utilizza pCAMBIA1302) e 400 mg/L-1 cefotaxima o 20 mg/L di tetraciclina. Incubare a 21-25 °C al buio per 2 giorni prima di metterli in una camera illuminata.
      NOTA: Le colonie resistenti appariranno 5-7 giorni dopo l'esposizione alla luce.
    7. Prelevare singole colonie dalla piastra di trasformazione e ri-striarle su piastre di agar TAP integrate con 400 mg/L di cefotaxima o 20 mg/L di tetraciclina e 20-70 mg/L di igromicina B.

4. PCR di colonia (cPCR) per confermare l'integrazione genica nei trasformanti di C. vulgaris

  1. Estrarre il DNA genomico da un trasformante di C. vulgaris dopo aver subcolturato almeno due volte da una singola colonia utilizzando un kit di estrazione del DNA genomico vegetale (vedi Tabella dei materiali). Usando questo come modello per la PCR, progetta primer per la regione mgfp5 del T-DNA (mgfp5-Fwd: 5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3' e M13-Rev: 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3').
    1. Utilizzando un kit di master mix di DNA polimerasi ad alta fedeltà Q5 (vedere la tabella dei materiali), eseguire la reazione a catena della polimerasi (PCR) per convalidare l'integrazione del transgene.
      NOTA: Per il presente studio sono state utilizzate le seguenti condizioni: 98 °C per 3 min; 35 cicli (98 °C per 10 s, 57 °C per 30 s, 72 °C per 1 min); 72 °C per 5min. Utilizzare pCAMBIA1302 come controllo positivo e DNA genomico di C. vulgaris wild-type come controllo negativo.
  2. Per confermare che non è presente pCAMBIA1302 nel campione a causa della contaminazione residua da A. tumefaciens, utilizzare la PCR di colonia. Aggiungere una piccola quantità di cellule trasformanti a 10 μL di acqua sterile e far bollire a 98 °C per 15 minuti. Usalo come modello per la PCR.
    1. Progettare primer per una regione al di fuori del T-DNA su pCAMBIA1302 (B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3' e B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3').
      NOTA: Per il presente studio sono state utilizzate le seguenti condizioni: 94 °C per 3 minuti; 30 cicli (94 °C per 30 s, 48 °C per 30 s, 68 °C per 5 min); 68 °C per 7 min. Utilizzare una colonia bollita di A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) come controllo positivo e una colonia bollita di C. vulgaris selvatico come controllo negativo.
  3. Per confermare che non vi sia contaminazione da A. tumerfaciens presente nel campione, utilizzare la PCR di colonia. Aggiungere una piccola quantità di cellule trasformanti a 10 μL di acqua sterile e far bollire a 98 °C per 15 minuti. Usalo come modello per la PCR.
    1. Progettare primer per il gene virE2 contenuto nel plasmide di virulenza AGL-1 (virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' e virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3').
      NOTA: Per il presente studio sono state utilizzate le seguenti condizioni: 94 °C per 3 minuti; 30 cicli (94 °C per 30 s, 53 °C per 30 s, 68 °C per 3 min); 68 °C per 7 min. Utilizzare una colonia bollita di A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) come controllo positivo e una colonia bollita di C. vulgaris selvatico come controllo negativo.
  4. Eseguire campioni di PCR su un gel di agarosio di DNA insieme a una scala (scala di DNA da 1 Kbp, vedere la tabella dei materiali) per confermare le dimensioni dei frammenti risultanti16.

5. Misurazione della fluorescenza dei trasformanti

  1. Inoculare ciascun trasformante da una coltura di mantenimento in fase logaritmica o da un agar TAP inclinato in 50 mL di TAP integrato con 200 mg/L-1 di cefotaxima e 25 mg/L-1 di igromicina B in modo tale che il OD iniziale600 = 0,1. Inoculare una coltura con C. vulgaris wild-type e solo 200 mg/L-1 di cefotaxima come controllo negativo. Incubare a 25 °C a 150 giri/min con 150 μmol/m2s di luce fotosinteticamente attiva (vedi Tabella dei materiali).
  2. Ogni 24 ore, prelevare un campione di 300 μL e misurare l'assorbanza e la fluorescenza (eccitazione 488 nm, emissione 526 nm) in un lettore di piastre a 96 pozzetti o in uno spettrometro UV/Vis e fluorimetro (vedere la tabella dei materiali). Utilizzare una piastra nera con fondo trasparente per misurazioni simultanee.

6. Estrazione di proteine grezze, purificazione di proteine ed elettroforesi SDS-PAGE

  1. Inoculare il trasformante (#50) da una coltura di mantenimento in fase logaritmica in 300 mL di TAP integrato con 200 mg/L-1 di cefotaxima e 25 mg/L-1 di igromicina B per raggiungere l'OD680 = 0,1. Inoculare una coltura con C. vulgaris wild-type e solo 200 mg/L-1 di cefotaxima come controllo negativo. Incubare a 25 °C a 150 rpm con 150 μmol/m2s di luce fotosinteticamente attiva.
  2. Estrarre il campione di proteina grezza dal trasformante (#50) e dai ceppi wild-type utilizzando un tampone di lisi da 5 mL (vedere la Tabella 1), seguito da sonicazione per 4 minuti.
  3. Purificare il campione di proteina grezza con una resina Ni-NTA attraverso colonne di polipropilene da 5 mL (vedi Tabella dei materiali).
  4. Liofilizzare i campioni proteici purificati da 15 mL e risospenderli in un tampone di lisi da 1 mL per l'analisi SDS-PAGE17.

Risultati

Per dimostrare il successo della trasformazione utilizzando il metodo di cui sopra, C. vulgaris è stato co-coltivato con AGL-1 contenente il plasmide pCAMBIA1302 o senza il plasmide (wild-type e placcato su agar TAP integrato con igromicina B e cefotaxima (Figura 1A). La placca più a sinistra mostra le colonie trasformate in grado di crescere sulle piastre di igromicina B/cefotaxima, mentre la placca centrale mostra che l'AGL-1 wild-type non può crescere sulle piastre di igromici...

Discussione

L'efficienza della trasformazione è associata a diversi parametri. La scelta dei ceppi di A. tumefaciens utilizzati per l'AMT è fondamentale. AGL-1 è uno dei ceppi più invasivi scoperti e, per questo motivo, è stato utilizzato abitualmente nell'AMT vegetale. Anche l'integrazione del mezzo di induzione con glucosio (15-20 mM) è importante per l'efficienza dell'AMT. Considerando che C. vulgaris può crescere sia in condizioni fototrofiche che eterotrofe, il glucosio o altre fonti di carbonio vengono...

Divulgazioni

Non sono stati dichiarati conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Gli autori desiderano ringraziare il Prof. Paul Hooykaas per aver gentilmente fornito il vettore pCAMBIA1302 e l'Agrobacterium tumefaciens AGL1 dell'Istituto di Biologia di Leida, Università di Leiden, Paesi Bassi. Gli autori desiderano anche ringraziare Eva Colic per il suo aiuto nella crescita dei trasformanti fluorescenti. Questo lavoro è stato finanziato dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada e dal programma Mitacs Accelerate.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1 Kb Plus DNA ladderFroggaBioDM015
AcetosyringoneFisher ScientificD26665G
Agrobacterium tumefaciensGold BiotechnologiesStrain: AGL-1; Gift from Prof. Paul HooykaasGenotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA
BiotinEnzo Life Sciences89151-400
CaCl2·2H2OVWRBDH9224-1KG
CefotaximeAK ScientificJ90010
Chlorella vulgarisUniversity of Texas at Austin Culture Collection of AlgaeStrain: UTEX 395Wildtype strain
CoCl2·6H2OSigma AldrichC8661-25G
CuSO4·5H2OEMD MilliporeCX2185-1
FeCl3·6H2OVWRBDH9234-500G
Gene Pulser Xcell ElectroporatorBio-Rad1652662Main unit equipped with PC module.
GeneJET Plant Genome Purification KitThermo ScientificK0791
Glacial acetic acidVWRCABDH3093-2.2P
GlycerolBioBasicGB0232
HEPES BufferSigma AldrichH-3375
Hygromycin BFisher ScientificAAJ6068103
K2HPO4VWRBDH9266-500G
KanamycinGold BiotechnologiesK-250-25
KH2PO4VWRBDH9268-500G
MgSO4·7H2OVWR97062-134
MnCl2·4H2OJT BakerBAKR2540-01
Na2CO3VWRBDH7971-1
Na2EDTA·2H2OJT Baker8993-01
Na2MoO4·2H2OJT BakerBAKR3764-01
NaClVWRBDH7257-7
NaH2PO4 H2OMillipore SigmaCA80058-650
NaNO3 VWRBDH4574-500G
NEBExpress Ni ResinNewEngland BioLabsNEB #S1427
NH4ClVWRBDH9208-500G
pCAMBIA1302Leiden UniversityGift from Prof. Paul HooykaaspBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator)
Polypropylene Columns (5 mL)QIAGEN34964
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mLBio-Rad1610363
RifampicinMillipore SigmaR3501-1G
SunBlaster LED Strip Light 48 Inch SunBlaster210000000906
Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer BioTEKS4MLFPTA
TetracyclineThermo Scientific ChemicalsCAAAJ61714-14
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12%Bio-Rad1610185
ThiamineTCI AmericaT0181-100G
Tris BaseFisher ScientificBP152-500
TryptoneBioBasicTG217(G211)
Vitamin B12 (cyanocobalamin)Enzo Life Sciences89151-436
Yeast ExtractBioBasicG0961
ZnSO4·7H2OJT Baker4382-01

Riferimenti

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