Sammenlignende undersøgelse af basalmembranmatricer til vedligeholdelse af humane stamceller og generering af tarmorganoider

Summary

Organoider er blevet værdifulde værktøjer til sygdomsmodellering. Den ekstracellulære matrix (ECM) styrer cellens skæbne under organoidgenerering, og ved at bruge et system, der ligner det oprindelige væv, kan det forbedre modellens nøjagtighed. Denne undersøgelse sammenligner genereringen af inducerede pluripotente stamceller-afledte humane tarmorganoider i dyreafledte ECM og xeno-frie hydrogeler.

Abstract

Ekstracellulær matrix (ECM) spiller en afgørende rolle i cellernes adfærd og udvikling. Organoider genereret fra humant inducerede pluripotente stamceller (hiPSC'er) er i søgelyset på mange forskningsområder. Manglen på fysiologiske signaler i klassiske cellekulturmaterialer hindrer imidlertid effektiv iPSC-differentiering. Inkorporering af kommercielt tilgængelig ECM i stamcellekultur giver fysiske og kemiske signaler, der er gavnlige for cellevedligeholdelse. Animalske kommercielt tilgængelige basalmembranprodukter er sammensat af ECM-proteiner og vækstfaktorer, der understøtter cellevedligeholdelse. Da ECM har vævsspecifikke egenskaber, der kan modulere celleskæbne, bruges xeno-frie matricer til at streame oversættelse til kliniske undersøgelser. Mens kommercielt tilgængelige matricer er meget udbredt i hiPSC- og organoidarbejde, er ækvivalensen af disse matricer endnu ikke blevet evalueret. Her blev der udført en sammenlignende undersøgelse af hiPSC-vedligeholdelse og generering af humane tarmorganoider (hIO) i fire forskellige matricer: Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB) og VitroGel (Matrix 4-XF). Selvom kolonierne manglede en perfekt rund form, var der minimal spontan differentiering, hvor over 85 % af cellerne udtrykte stamcellemarkøren SSEA-4. Matrix 4-XF førte til dannelsen af 3D-runde klumper. Forøgelse af koncentrationen af tilskuds- og vækstfaktorer i de medier, der bruges til at fremstille Matrix 4-XF-hydrogelopløsningen, forbedrede også hiPSC-ekspressionen af SSEA-4 med 1,3 gange. Differentiering af Matrix 2-AB-vedligeholdt hiPSC førte til færre sfæroidudslip i midt-/bagtarmsstadiet sammenlignet med de andre dyreafledte basalmembraner. Sammenlignet med andre fører den xeno-fri organoidmatrix (Matrix 4-O3) til større og mere moden hIO, hvilket tyder på, at de fysiske egenskaber af xeno-frie hydrogeler kan udnyttes til at optimere organoidgenerering. Alt i alt tyder resultaterne på, at variationer i sammensætningen af forskellige matricer påvirker stadier af IO-differentiering. Denne undersøgelse øger bevidstheden om forskellene i kommercielt tilgængelige matricer og giver en guide til matrixoptimering under iPSC- og IO-arbejde.

Introduction

Den ekstracellulære matrix (ECM) er en dynamisk og multifunktionel komponent i væv, der spiller en central rolle i reguleringen af celleadfærd og udvikling. Som et komplekst netværk giver det strukturel støtte, celleklæbende ligander¹ og lagring af vækstfaktorer og cytokiner, der regulerer cellesignalering. For eksempel fungerer ECM under sårheling som et stillads for migrerende celler og som et reservoir af vækstfaktorer, der er involveret i vævsreparation². På samme måde kan dysregulering i ECM føre til en stigning i sværhedsgraden af forskellige sygdomme såsom fibrose og kræft ^3,4

Protocol

1. HiPSC vedligeholdelse

FORSIGTIG: Alt arbejde udføres i et biosikkerhedsskab (BSC) efter standard aseptiske teknikker. Skal følge OSHA's sikkerhedsstandarder for laboratorier, herunder korrekt brug af personlige værnemidler såsom laboratoriefrakker, handsker og beskyttelsesbriller.

1. Fremstilling af matricer, alikvoter og cellekulturmedier
   1. For kommercielt tilgængelige dyreafledte basalmembraner (BM'er; Matrix 1-AB, Matrix 2-AB, Matrix 3-AB), fremstilles a.......

Discussion

Valg af det optimale mikromiljø til stamcelle- og organoidarbejde er et afgørende tidligt skridt, når man bruger disse platforme til en bred vifte af applikationer. Vores repræsentative resultater viser, at Matrix 4-XFO3 i kombination med en højere koncentration af vækstfaktorer fører til større organoider, hvilket tyder på, at de fysiske egenskaber af xenofrie hydrogeler kan udnyttes til at optimere organoidgenerering ved hjælp af disse systemer. Det er tidligere blevet vist, at de unikke egenskaber ved den ek.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-Well Plate (Culture treated, sterile)	Falcon	353504
37 °C water bath	VWR
96-well plate	Fisher Scientific	FB012931
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634
Anti-adherence Rinsing Solutio	STEMCELL Technologies	7010
Biological safety cabinet (BSC)	Labconco	Logic
Brightfield Microscope	Echo Rebel	REB-01-E2
BXS0116	ATCC	ACS-1030
Centrifuge with temperature control (4 °C capabilities)	ThermoScientific	75002441
Conical tubes, 15 mL, sterile	Thermo Fisher Scientific	339650
Conical tubes, 50 mL, sterile	Thermo Fisher Scientific	339652
Cultrex RGF BME, Type 2	Bio-techne	3533-005-02
Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME	Bio-techne	3434-010-02
D-PBS (Without Ca++ and Mg++)	Thermo Fisher Scientific	14190144
GeltrexLDEV-Free, hESC-Qualified Reduce Growth Factor	Gibco	A14133-02
GlutaMAX Supplement	Thermo Fischer Scientific	35050-061
Guava Muse Cell Analyzer or another flow cytometry equipment (optional)	Luminex	0500-3115
HEPES buffer solution	Thermo Fischer Scientific	15630-056
Heralcell Vios Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2)	Thermo Scientific	51033775
JMP Software	SAS Institute	JMP 16
MATLAB	MathWorks, Inc	R2022b
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix LDEV free	Corning	356231
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Growth Factor Reduced (GFR) LDEV-free	Corning	354263
mTeSR Plus Medium	STEMCELL Technologies	100-0276
Nunclon Delta surface treated 24-well plate	Thermo Scientific	144530
PE Mouse Anti-human CD326 (EpCAM)	BD Pharmingen	566841
PE Mouse Anti-human CDX2	BD Pharmingen	563428
PE Mouse Anti-human FOXA2	BD Pharmingen	561589
PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-human SSEA4	BD Pharmingen	561565
ReLeSR	STEMCELL	5872
SCTi003-A	STEMCELL Technologies	200-0510
Serological pipettes (10 mL)	Fisher Scientific	13-678-11E
Serological pipettes (5 mL)	Fisher Scientific	13-678-11D
STEMdiff Intestinal Organoid Growth Medium	STEMCELL Technologies	5145
STEMdiff Intestinal Organoid Kit	STEMCELL Technologies	5140
Vitrogel Hydrogel Matrix	TheWell Bioscience	VHM01
VitroGel ORGANOID Discovery Kit	TheWell Bioscience	VHM04-K