Sunulan protokol çok kolaydır ve araştırmacılarbirincil adrenal kültürleri hazırlamak yardımcı olacaktır. Bu adrenal steroidogenez başlatmak için kolay bir prosedür sağlar. Bu teknik strese bağlı hastalıkların, ajan inhibe inflamatuar yanıtların tüm potansiyellerinin taranması nda uygulanabilir.
Prosedürü gösteren Wei-Chang Lee, benim laboratuvarımdan bir Master öğrencisi olacak. %70 etanol kullanarak ötenazi SD sıçan sterilize ve deriiçine emilir izin ile başlayın. Mendil kağıdı ile deri sildikten sonra, supine pozisyonda temiz bir plastik plaka üzerinde sıçan yerleştirin.
Daha sonra, orta hatta deri kaldırmak için dış kavisli forseps kullanın. Subkostal açı uyluk seviyesinden bir Y şekli oluşturarak cildin künt bir diseksiyon gerçekleştirmek için makas kullanın. % 70 etanol ile makas durulama sonra, kas kesmek, ayrıca bir Y şekli oluşturarak.
Karaciğer arkasında sağ mide arkasında sol adrenal bezi bulun. Standart forseps bir çift ve kavisli forseps bir çift ile, mide ve karaciğer asansör ve daha sonra başka bir kavisli forseps ile adrenalizole ve steril bir çanak içine yerleştirin. Dikkatle her bezinden adrenal kapsül taşımak için ince forceps kullanın.
Şimdi, doku kapsayacak şekilde serum içermeyen DMEM F-12 orta yeterli miktarda küçük parçalar halinde adrenal kesmek için makas hassas bir çift kullanın. Bir brülör üzerinde ısıtarak üç farklı dökme boyutu pastör pipetler hazırlayın. Kollajenaz II.Gently Pipet doku parçaları yaklaşık 10 kez yukarı ve aşağı içeren bir 50mL konik tüp içine tüm adrenal parçaları aktarmak için en büyük açılış ile ilk pipet kullanın.
Sonra 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir su banyosunda tüp kuluçka ve her beş dakikada bir sallayın, toplam dört kez. Enzim sindirimi sırasında doku dağılımını düzgün bir şekilde gerçekleştirmek çok önemlidir. Tüm doku parçaları küçülene kadar pipetleme ve kuluçka tekrarlamak için ikinci ve daha sonra en küçük dökme boyutu pipet kullanın.
Sonra enzimatik reaksiyonu durdurmak için dört derece santigrat soğuk orta bresh altı kat hacmi ekleyin. Sonra 10 dakika boyunca 800 kez G centrafuge ve supernatant her iki kez atın. Uygun bir ortam hacmi ekleyin ve hücreleri yeniden askıya alın.
Hücreleri istenilen tabaklara veya yemeklere, bir gecede 37 derece nem ve %5 karbondioksit le 37 derece lik bir oranda yetiştirin. Ertesi gün hücreleri serumsuz, sıcak DMEM F-12 ortamı ile iki kez dikkatlice yıkayın. Taze büyüme ortamı ekleyin ve 3Gün'e kadar hücreleri 37 santigrat derece, %95 nem ve %5 karbondioksitle koruyun.
Bu protokol kullanılarak birincil kültürlenmiş sıçan adrenal hücreleri elde edildi. Gün 3 adrenal hücreler faz kontrast mikroskop altında doğrulandı. 3. günde yapılan yağ farklılaşmasına bağlı proteinin immünororesan boyaması sitoplazma içindeki veziküllerin lipid damlacıkları olduğunu doğrulamıştır.
Sıçan adrenal hücrelerinin adrenokortikotropik hormon stimülasyonu sonra, hücrelerin hormon üreten yeteneği kortikosteron tsay tarafından tespit edildi, yüksek ACTH konsantrasyonu ile artmış kortikosteron salınımını gösteren. Bu yöntem primer kalp kültürleri, adrenal medulla kültürleri vesaire gibi diğer birincil kültür sistemlerine uygulanabilir. Bu teknik aynı zamanda adrenokortikal hücreler ve kromatin hücreleri arasındaki etkileşimi araştırmak için yardımcı olabilir.
