Name: determination of total lipid and lipid classes in marine samples
Uploaded: 2021-12-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Total Lipid and Lipid Classes in Marine Samples at JoVE.com

Questa ricerca è stata finanziata dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) numero di sovvenzioni 105379 a C.C. Parrish. La rete Core Research Equipment & Instrument Training (CREAIT) della Memorial University ha contribuito a finanziare questa pubblicazione.

NOTA: Per pulire bicchieri, strumenti e filtri per analisi lipidiche, lavarli 3 volte con metanolo seguito da 3 lavaggi con cloroformio o riscaldarli a 450°C per almeno 8 ore.
1. Procedura di filtrazione per i lipidi disciolti e particolati dell'acqua di mare
NOTA: La particolare frazione di interesse è definita operativamente dalla procedura di filtrazione. In questo caso la dimensione dei pori è di 1,2 μm.
<ol><li>Impostare il collettore di ...

<ol>
	<li>Couturier, L. I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+art+and+best+practices+for+fatty+acid+analysis+in+aquatic+sciences.">State of art and best practices for fatty acid analysis in aquatic sciences.</a> ICES Journal of Marine Science. , (2020).</li><li>Parrish, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+in+Marine+Ecosystems.">Lipids in Marine Ecosystems.</a> ISRN Oceanography. , 604045 (2013).</li><li>Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).</li><li>Vaz, F. M., Pras-Raves, M., Bootsma, A. H., van Kampen, A. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+practice+of+lipidomics.">Principles and practice of lipidomics.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. , (2014).</li><li>Wolf, C., Quinn, P. 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C., P&#233;rez-Espa&#241;a, H., Agui&#241;iga-Garcia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elemental+ratios+and+lipid+classes+in+a+coral+reef+food+web+under+river+influence.">Elemental ratios and lipid classes in a coral reef food web under river influence.</a> Progress in Oceanography. 164, 1-11 (2018).</li><li>Maciel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprospecting+of+marine+macrophytes+using+MS-based+lipidomics+as+a+new+approach.">Bioprospecting of marine macrophytes using MS-based lipidomics as a new approach.</a> Marine Drugs. 14, 49 (2016).</li><li>Pernet, F., Tremblay, R., Comeau, L., Guderley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+adaptation+in+two+bivalve+species+from+different+thermal+habitats:+energetics+and+remodelling+of+membrane+lipids.">Temperature adaptation in two bivalve species from different thermal habitats: energetics and remodelling of membrane lipids.</a> Journal of Experimental Biology. 210, 2999-3014 (2007).</li><li>Bergen, B. J., Quinn, J. G., Parrish, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality-assurance+study+of+marine+lipid-class+determination+using+Chromarod/Iatroscan+thin-layer+chromatography-flame+ionization+detector.">Quality-assurance study of marine lipid-class determination using Chromarod/Iatroscan thin-layer chromatography-flame ionization detector.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 19, 2189-2197 (2000).</li><li>Foroutani, B. M., Parrish, C. C., Wells, J., Taylor, R. G., Rise, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+marine+ingredients+in+diets+of+farmed+Atlantic+salmon+(Salmo+salar):+effects+on+liver+and+head+kidney+lipid+class,+fatty+acid+and+elemental+composition.">Minimizing marine ingredients in diets of farmed Atlantic salmon (Salmo salar): effects on liver and head kidney lipid class, fatty acid and elemental composition.</a> Fish Physiology &amp; Biochemistry. 46, 2331-2353 (2020).</li><li>Parrish, C. C., Deibel, D., Thompson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+sinking+spring+phytoplankton+blooms+on+lipid+content+and+composition+in+suprabenthic+and+benthic+invertebrates+in+a+cold+ocean+coastal+environment.">Effect of sinking spring phytoplankton blooms on lipid content and composition in suprabenthic and benthic invertebrates in a cold ocean coastal environment.</a> Marine Ecology Progress Series. 391, 33-51 (2009).</li><li>Sinanoglou, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+combined+application+of+Iatroscan+TLC-FID+and+GC-FID+to+identify+total,+neutral,+and+polar+lipids+and+their+fatty+acids+extracted+from+foods.">On the combined application of Iatroscan TLC-FID and GC-FID to identify total, neutral, and polar lipids and their fatty acids extracted from foods.</a> ISRN Chromatography. , 59024 (2013).</li><li>Peters-Didier, J., Sewell, M. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+lipids+during+early+development+of+the+sea+urchin+Evechinus+chloroticus.">Utilization of lipids during early development of the sea urchin Evechinus chloroticus.</a> Marine Ecology Progress Series. 304, 133-142 (2005).</li><li>Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+polyunsaturated+and+saturated+lipids+from+marine+phytoplankton+on+silica+gel+coated+Chromarods.">Separation of polyunsaturated and saturated lipids from marine phytoplankton on silica gel coated Chromarods.</a> Journal of Chromatography A. 607, 97-104 (1992).</li><li>Stevens, C. J., Deibel, D., Parrish, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+bacterial+fatty+acids+and+changes+in+a+wax+ester-based+omnivory+index+during+a+long-term+incubation+experiment+with+Calanus+glacialis+Jaschnov.">Incorporation of bacterial fatty acids and changes in a wax ester-based omnivory index during a long-term incubation experiment with Calanus glacialis Jaschnov.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 303, 135-156 (2004).</li><li>Goutx, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+term+summer+to+autumn+variability+of+dissolved+lipid+classes+in+the+Ligurian+Sea+(NW+Mediterranean).">Short term summer to autumn variability of dissolved lipid classes in the Ligurian Sea (NW Mediterranean).</a> Biogeosciences. 6, 1229-1246 (2009).</li><li>Conlan, J. A., Rocker, M. M., Francis, D. S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=comparison+of+two+common+sample+preparation+techniques+for+lipid+and+fatty+acid+analysis+in+three+different+coral+morphotypes+reveals+quantitative+and+qualitative+differences.">comparison of two common sample preparation techniques for lipid and fatty acid analysis in three different coral morphotypes reveals quantitative and qualitative differences.</a> PeerJ. 5, 3645 (2017).</li></ol>

La velocità con cui il sistema TLC-FID fornisce informazioni sulla classe lipidica sinottica da piccoli campioni rende TLC-FID uno strumento in grado di selezionare campioni marini prima di intraprendere procedure analitiche più coinvolte. Tali analisi di solito richiedono il rilascio di composti componenti da estratti lipidici e la derivatizzazione per aumentare la volatilità nel caso della gascromatografia. TLC-FID combinato con GC-FID è stato trovato per essere una potente combinazione per estratti di frutti di ma...

I metodi qui descritti riguardano sostanze che sono definite operativamente come lipidi marini. Questa definizione si basa sulla loro suscettibilità all'estrazione liquido-liquido in solventi organici non polari e fornisce un metodo conveniente per la loro separazione da altre sostanze in una matrice acquatica. La loro natura idrofoba facilita il loro isolamento dall'acqua di mare o dai campioni biologici, così come il loro arricchimento e la rimozione di sali e proteine.
La misurazione del contenuto lipidico e della sua composizione negli organismi marini è stata di grande interesse per l'ecologia della rete alimentare, la nutrizione dell'acquacoltura e la scienza dell'alimentazione per decenni. I lipidi sono componenti universali negli organismi viventi, che agiscono come molecole essenziali nelle membrane cellulari, come principali fonti di energia biodisponibile, fornendo isolamento termico e galleggiabilità e fungendo da molecole di segnalazione. Sebbene le procedure per la determinazione dei lipidi in altri campi siano state descritte bene, il loro uso con campioni marini richiede comunemente modifiche per adattarsi alle condizioni del campo e al tipo di campione1.
Per i campioni di acqua di mare, la prima fase di solito richiede la separazione nelle frazioni "disciolte" e "particolato" definite operativamente, normalmente mediante filtrazione (fase 1 del protocollo). La frazione di particolato è ciò che viene trattenuto dal filtro e la dimensione dei pori è importante nella definizione del cut-off2. Spesso, quando campioniamo il particolato, vorremmo mettere in relazione le concentrazioni lipidiche con le concentrazioni di massa totale, nel qual caso un campione separato, più piccolo, (ad esempio, 10 ml) deve essere preso per questo scopo (protocollo passo 1, nota). Per ottenere una determinazione accurata della massa è importante aggiungere il formate di ammonio (35 g/L) alla fine della filtrazione.
Il filtrato di acqua di mare dal campione più grande deve ammontare tra 250 ml e 1 L a seconda del tipo di campione ed è sottoposto all'estrazione liquido-liquido in un imbuto separatore (fase 2 del protocollo). La natura idrofobica dei lipidi significa che possono essere separati da altri composti mediante estrazione in un solvente non polare come il cloroformio. Viene creato un sistema a due strati in cui i lipidi si dividono nello strato organico mentre i componenti solubili in acqua rimangono nello strato acquoso.
Campioni di particolato su un filtro, o campioni biologici vengono estratti con un'estrazione modificata di Folch et al.3, che coinvolge anche il cloroformio (fase del protocollo 3). Ancora una volta, viene creato un sistema organico / acquoso in cui i lipidi si dividono nella fase organica, mentre le molecole solubili in acqua rimangono nella fase acquosa e le proteine vengono precipitate. Infatti, per i solidi, la maggior parte dei laboratori utilizza alcune variazioni della procedura di estrazione Folch et al.3 che coinvolge cloroformio e metanolo. Per i filtri, il primo passo è omogeneizzare in 2 ml di cloroformio e 1 ml di metanolo.
Durante l'estrazione, è necessario prestare attenzione per proteggere i lipidi da modifiche chimiche o enzimatiche, mantenendo campioni e solventi sul ghiaccio per ridurre l'idrolisi del legame estere o l'ossidazione a doppio legame carbonio-carbonio. I tessuti e i lipidi cellulari sono abbastanza ben protetti dagli antiossidanti naturali e dalla compartimentazione4; tuttavia, a seguito dell'omogeneizzazione dei campioni, il contenuto cellulare viene combinato rendendo i lipidi più disposti all'alterazione, chimicamente o enzimaticamente. Alcuni lipidi, come la maggior parte degli steroli, sono molto stabili, mentre altri, come quelli contenenti acidi grassi polinsaturi, sono più suscettibili all'ossidazione chimica. Altri, come gli steroli con doppi legami coniugati, sono inclini all'ossidazione catalizzato dalla luce5. Dopo le estrazioni, i lipidi sono molto più suscettibili all'ossidazione chimica e i campioni devono essere conservati sotto un gas inerte come l'azoto. Un flusso delicato di azoto verrebbe anche usato per concentrare gli estratti.
Dopo la concentrazione, i lipidi sarebbero normalmente quantificati alla rinfusa in quanto sono una componente importante degli ecosistemi marini che forniscono un'alta concentrazione di energia, più del doppio del kJ / g di carboidrati e proteine. Invariabilmente verrebbero poi quantificati come singoli componenti: l'analisi completa dei lipidi comporta generalmente la separazione in categorie più semplici, in base alla loro natura chimica. Pertanto, un'analisi completa comporta la misurazione dei lipidi totali, delle classi lipidiche e dei singoli composti.
Il lipide totale può essere determinato prendendo la somma delle classi lipidiche misurate individualmente separate dalla cromatografia6. Un estratto lipidico marino può contenere più di una dozzina di classi da fonti biogeniche e antropogeniche. L'ampia varietà di strutture lipidiche significa che molte informazioni possono essere ottenute determinando singoli raggruppamenti di strutture. Le classi lipidiche individualmente, o in alcuni gruppi, sono state utilizzate per segnalare la presenza di alcuni tipi di organismi, nonché il loro stato fisiologico e l'attività2. Sono stati anche utilizzati come indicatore delle origini del materiale organico, compresa la materia organica disciolta (DOM) e i contaminanti idrofobici.
Triacilgliceroli, fosfolipidi e steroli sono tra le più importanti classi lipidiche biogeniche. I primi due sono biochimicamente correlati in quanto possiedono una spina dorsale di glicerolo a cui sono esterificati due o tre acidi grassi (Figura 1). I triacilgliceroli, insieme agli esteri di cera, sono sostanze di stoccaggio molto importanti, mentre altre classi lipidiche contenenti acidi grassi come diacilgliceroli, acidi grassi liberi e monoacilgliceroli sono generalmente costituenti minori. Gli acidi grassi liberi sono presenti a concentrazioni più basse negli organismi viventi, in quanto quelli insaturi possono essere tossici7. Anche gli steroli (sia nelle loro forme libere che esterificate) e gli alcoli grassi sono inclusi tra i lipidi meno polari, mentre i glicolipidi e i fosfolipidi sono lipidi polari. I lipidi polari hanno un gruppo idrofilo, che consente la formazione di doppi strati lipidici presenti nelle membrane cellulari. Gli steroli liberi sono anche componenti strutturali della membrana e, se assunti in rapporto ai triacilgliceroli, forniscono una condizione o un indice nutrizionale (TAG: ST) che è stato ampiamente utilizzato8. Se presi in rapporto ai fosfolipidi (ST: PL) possono essere utilizzati per indicare la sensibilità delle piante al sale: valori più alti mantengono l'integrità strutturale e diminuiscono la permeabilità della membrana9. L'inverso di questo rapporto (PL: ST) è stato studiato nei tessuti bivalvi durante l'adattamento della temperatura10.
Le classi lipidiche marine possono essere separate mediante cromatografia a strato sottile (TLC) su barre rivestite in gel di silice (fase 4 del protocollo) e quindi rilevate e quantificate mediante rilevamento della ionizzazione di fiamma (FID) in uno scanner FID automatico. TLC / FID è diventato abitualmente utilizzato per i campioni marini in quanto fornisce rapidamente dati di classe lipidica sinottica da piccoli campioni e, prendendo la somma di tutte le classi, un valore per i lipidi totali. TLC/FID è stato sottoposto a una valutazione di garanzia della qualità (QA) ed è risultato che soddisfa gli standard richiesti per una calibrazione esterna coerente, spazi vuoti bassi e analisi di replica precisa11. I coefficienti di variazione (CV) o le deviazioni standard relative sono intorno al 10% e i dati lipidici totali dello scanner FID sono normalmente circa il 90% di quelli ottenuti con metodi gravimetrici e altri metodi2. La gravimetria dà lipidi totali più elevati probabilmente perché lo scanner FID misura solo composti non volatili e anche come risultato della possibile inclusione di materiale non lipidico nelle misurazioni gravimetriche.
Le informazioni fornite dall'analisi della classe lipidica sono particolarmente utili se combinate con le determinazioni degli acidi grassi come individui, o steroli, o i due in combinazione. Il primo passo verso queste analisi prevede il rilascio di tutti gli acidi grassi componenti insieme agli steroli negli estratti lipidici (fase 5 del protocollo). L'ampia varietà di strutture e funzioni lipidiche significa che hanno visto un ampio uso in studi ecologici e biogeochimici che valutano la salute dell'ecosistema e la misura in cui sono stati influenzati da input antropogenici e terrestri. Sono stati utilizzati per misurare la biosintesi di sostanze di valore dietetico per la fauna marina e per indicare la qualità dei campioni di acqua. La misurazione dei lipidi nei campioni di carote di sedimenti aiuta a mostrare la sensibilità dei sedimenti ai cambiamenti nell'uso del suolo umano vicino al margine terra-mare.
Lo strumento principale per identificare e quantificare i singoli composti lipidici è stato tradizionalmente la gascromatografia (GC) con FID. Prima dell'analisi, tuttavia, questi composti sono resi più volatili dalla derivatizzazione. Gli acidi grassi vengono rilasciati in presenza di un catalizzatore acido (H2SO4) dalle classi lipidiche acilice (Figura 1). In chimica organica, il gruppo acilico (R-C = O) è solitamente derivato da un acido carbossilico (R-COOH). Vengono quindi riesterificati in esteri metilici degli acidi grassi (FAME) che danno migliori separazioni sulle colonne GC (fase del protocollo 5).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66009-560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-hexadecanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>258741-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Monopalmitoyl-rac-glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1640-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>46610-722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm glass fibre filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09 874 32A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2ml pipet bulbs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>47 mm glass fibre filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09 874 32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 3/4&#34; pipets</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367820A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; pipets</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367820C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CAAX0116-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent GC-FID 6890</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride ANHS 500gm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CACX0160-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caps for 2 ml vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>46610-712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CACX1054-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesteryl palmitate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6072-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromarod S5</td>
			<td>Shell USA</td>
			<td>3252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CADX0831-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-a-phosphatidylcholine, dipalmotoyl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5911-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Ether, ACS grade anhydr 4L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CAEX0190-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glyceryl tripalmitate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5888-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton Syringe 702SNR 25&#181;l</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>58381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helium</td>
			<td>Air Liquide</td>
			<td>A0492781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CAHX0296-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen regulator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55850-484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iatroscan MK6</td>
			<td>Shell USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>066662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Air</td>
			<td>Air Liquide</td>
			<td>A0464563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium nitrile gloves</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>191301597C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA82013-782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen</td>
			<td>Air Liquide</td>
			<td>A0464775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen Regulator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55850-474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonadecane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74158-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0500-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeating dispenser</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate 1kg</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA97062-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Sulfate Anhy ACS 500gr</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA71008-804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CASX1244-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14610120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue master 125 115V w/7mm homogenator</td>
			<td>OMNI International</td>
			<td>TM125-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC development tank</td>
			<td>Shell USA</td>
			<td>3201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UHP hydrogen</td>
			<td>Air Liquide</td>
			<td>A0492788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR solvent repippetter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82017-766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR timer Flashing LED 2 channel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89140-196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebron ZB-Wax GC column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>7HM-G013-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of total lipid and lipid classes in marine samples

I lipidi sono in gran parte composti da carbonio e idrogeno e, quindi, forniscono una maggiore energia specifica rispetto ad altre macromolecole organiche nel mare. Essendo ricchi di carbonio e idrogeno sono anche idrofobici e possono agire come solvente e vettore di assorbimento per contaminanti organici e quindi possono essere driver di bioaccumulo inquinante negli ecosistemi marini. La loro natura idrofobica facilita il loro isolamento dall'acqua di mare o da campioni biologici: l'analisi lipidica marina inizia con il campionamento e poi l'estrazione in solventi organici non polari, fornendo un metodo conveniente per la loro separazione da altre sostanze in una matrice acquatica.
Se l'acqua di mare è stata campionata, il primo passo di solito comporta la separazione in fazioni "disciolte" e "particolato" definite operativamente mediante filtrazione. I campioni vengono raccolti e i lipidi isolati dalla matrice del campione tipicamente con cloroformio per materia veramente disciolta e colloidi, e con miscele di cloroformio e metanolo per solidi e campioni biologici. Tali estratti possono contenere diverse classi da fonti biogeniche e antropogeniche. In questo momento, i lipidi totali e le classi lipidiche possono essere determinati. Il lipide totale può essere misurato sommando le classi lipidiche determinate individualmente che di solito sono state separate cromatograficamente. La cromatografia a strato sottile (TLC) con rilevamento della ionizzazione di fiamma (FID) viene regolarmente utilizzata per l'analisi quantitativa dei lipidi da campioni marini. TLC-FID fornisce informazioni sulla classe lipidica sinottica e, sommando le classi, una misurazione lipidica totale.
Le informazioni sulla classe lipidica sono particolarmente utili se combinate con misurazioni di singoli componenti, ad esempio acidi grassi e / o steroli, dopo il loro rilascio da estratti lipidici. L'ampia varietà di strutture e funzioni lipidiche significa che sono ampiamente utilizzate nella ricerca ecologica e biogeochimica che valuta la salute dell'ecosistema e il grado di influenza degli impatti antropogenici. Sono stati impiegati per misurare sostanze di valore dietetico per la fauna marina (ad esempio, acquafeed e / o prede) e come indicatore della qualità dell'acqua (ad esempio, idrocarburi).

Essendo il settore della produzione alimentare in più rapida crescita, l'acquacoltura si sta evolvendo in termini di innovazioni tecnologiche e adattamenti per soddisfare le mutevoli esigenze. Uno di questi è ridurre la dipendenza dalla farina di pesce e dall'olio di pesce di origine selvatica, che forniscono ingredienti per mangimi per molte specie di acquacoltura. Gli oli vegetali terrestri sono stati studiati come sostituti sostenibili ed economici dell'olio di pesce negli aquafeed e il fegato è un tessuto bersagli...

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Determination of Total Lipid and Lipid Classes in Marine Samples

Questo protocollo è per la determinazione dei lipidi in acqua di mare e campioni biologici. I lipidi nei filtrati vengono estratti con cloroformio o miscele di cloroformio e metanolo nel caso di solidi. Le classi lipidiche sono misurate mediante cromatografia a strato sottile con rilevamento della ionizzazione a fiamma e la loro somma fornisce il contenuto lipidico totale.

Determinazione delle classi lipidiche e lipidiche totali in campioni marini

Lipids are largely composed of carbon and hydrogen and, therefore, provide a greater specific energy than other organic macromolecules in the sea. Being ...

I metodi qui descritti riguardano composti che possono essere definiti operativamente come lipidi marini. La base di questa definizione è la loro suscettibilità all'estrazione liquido-liquido in solventi organici non polari, che fornisce un mezzo conveniente per separarli da altri composti in una matrice acquosa. La loro natura idrofoba facilita il loro isolamento dall'acqua di mare o da campioni biologici, nonché il loro arricchimento e la rimozione di sali e proteine.Per i campioni di acqua di mare, il primo passo normalmente comporta la separazione in frazioni disciolte e particolato definite operativamente, di solito mediante filtrazione. La frazione di particolato è quella trattenuta dai filtri e la dimensione dei pori è importante per definire il cutoff. Utilizzando una pinza ipolipe pulite, posizionare un filtro in fibra di vetro da 47 millimetri che è stato incenerato su un sistema di filtrazione lipidico-pulito.Prendi il campione e ruotalo delicatamente per risospendare eventuali particelle che potrebbero essersi depositate. Misurare un volume noto. Il volume dipenderà dalla quantità di particolato nel campione.Quando il volume viene misurato, aggiungere l'aspirazione al sistema di filtrazione e bagnare delicatamente il filtro con acqua di mare filtrata. Aggiungere lentamente l'intero campione all'imbuto di filtrazione e risciacquare il cilindro graduato con acqua di mare per assicurarsi che tutte le particelle vengano aggiunte al filtro. Risciacquare l'imbuto dell'apparecchio per assicurarsi che tutte le particelle vengano risciacquate sul filtro.Tirare tutto il liquido attraverso il filtro, ma non lasciare asciugare il filtro, in quanto può rompere le celle che si trovano sul filtro. Prendi la pinza lipidica pulita, piega il filtro a metà, quindi piegalo in terzi ancora una volta, e poi a metà longitudinalmente. Il filtro viene quindi posto in un flaconcino ipolide-pulito.Coprire il filtro con due ml di cloroformio, tappare sotto azoto e sigillare con nastro di teflon. A questo punto, il campione sarà stabile in deposito a meno 20 gradi Celsius per un massimo di un anno. Preparazione del campione.Misurare un volume noto del filtrato in un cilindro graduato in vetro lipidico pulito. Posizionare il campione in un imbuto separatore lipidico pulito e aggiungere circa 20 ml di cloroformio. Agitare questa miscela per almeno due minuti sfogandosi frequentemente.Dopo la prima separazione, la rimozione del primo estratto e l'aggiunta di acido. Dopo aver agitato la soluzione per due minuti, avvolgere l'imbuto in un foglio di alluminio e attendere fino a quando non si è verificata la separazione, circa cinque minuti. Dopo aver atteso la separazione, staccare il fondo del foglio di alluminio per vedere i due strati.Raccogliere lo strato inferiore in un pallone rotondo a fondo lipidico, facendo attenzione a non includere nessuno degli strati superiori. Tappare il matraccio a fondo tondo sotto azoto e metterlo in un congelatore. Recuperare l'imbuto separatore e aggiungere acido solforico al liquido.Aggiungere 0,25 ml per ogni litro di acqua di mare presente. Una volta aggiunto l'acido solforico, agitare delicatamente l'acqua di mare, quindi aggiungere altri 10 ml di cloroformio e agitare vigorosamente mentre si sfoga per altri due minuti. Quindi consentire la separazione.Seconda e terza separazione. Aggiungere nuovamente lo strato inferiore al pallone a fondo tondo senza includere acqua. Aggiungere una terza quantità di 10 ml di cloroformio e agitare per altri due minuti con lo sfiato.Dopo la separazione, posizionare la porzione finale di cloroformio nello stesso pallone e gli estratti combinati possono essere evaporati mediante evaporatore rotante e trasferiti in un flaconcino da due ml. Apparecchio. Per la configurazione dell'estrazione, avrai bisogno di un contenitore isolato pieno di ghiaccio. I solventi includono cloroformio, acqua estratta dal cloroformio e cloroformio-metanolo 2:1.Di questa soluzione, hai bisogno di circa un ml per campione, quindi fallo di conseguenza. Tutti questi solventi devono essere posti sul ghiaccio in modo che siano freddi al momento dell'inizio delle estrazioni. I campioni vanno anche sul ghiaccio in modo che tutto rimanga freddo.Macinazione ed estrazione. I campioni sono stati conservati congelati in due ml di cloroformio, quindi aggiungere un ml di metanolo ghiacciato o mezzo pipetful. Fare attenzione quando si aggiunge il metanolo per non toccare il flaconcino con il pipetto.Pulire e omogeneizzare tre volte con metanolo e tre volte con cloroformio. Durante la macinazione, fare attenzione a non tagliare la fiala di estrazione in mano nel caso in cui si rompa la fiala e per evitare di riscaldare il campione. Macinare rapidamente.Una volta che il campione è stato completamente macinato, metterlo nel ghiaccio e lavare le particelle rimanenti dalla smerigliatrice nel flaconcino usando un ml di cloroformio-metanolo 2:1. Se necessario, utilizzare un set di pinza ipolipidico per forzare le particelle nel flaconcino prima del lavaggio. Fare attenzione a non toccare la pipetta alla smerigliatrice o la smerigliatrice alla fiala.Quindi aggiungere 0,5 ml o un quarto di pipetta di acqua estratta dal cloroformio senza toccare la smerigliatrice o la smerigliatrice al flaconcino. Quando la smerigliatrice è stata lavata, toccare la goccia appesa dalla smerigliatrice al flaconcino. Tappare e tenerlo nel ghiaccio fino a quando non è pronto per sonicare.Doppio pipettaggio. Dopo la centrifugazione, ci saranno due strati nella fiala: gli strati organici e acquosi. Per ottenere lo strato organico, viene utilizzata la tecnica del doppio pipettaggio.Per fare ciò, un breve pipetto di cinque centimetri con la lampadina messa liberamente viene afferrato tra l'indice e il dito medio. Spingere delicatamente il pipetto verso il basso attraverso i due strati mentre si spreme il bulbo causando bolle che escono fino alla fine. Quando viene raggiunto il fondo del secondo strato, usa il pollice per staccare la lampadina senza disegnare lo strato organico nel pipetto.Con un pipetto di nove centimetri spremere completamente la lampadina. Mettere l'estremità lunga del pipetto nel pipetto di cinque centimetri e rimuovere lo strato inferiore attraverso il pipetto di cinque centimetri. Questo estratto viene quindi posto in una fiala lipidica-pulita.Continua a togliere lo strato inferiore fino a quando non viene rimosso tutto. Tutti gli strati di pooled nel flaconcino lipidico-pulito. Pipette di lavaggio.Rimuovere la lampadina dal pipetto di nove centimetri. Mettilo nel flaconcino con l'estratto al suo posto. Prendi un pipetto di cloroformio pulito e, senza toccare il pipetto a quello da lavare, spruzza il cloroformio intorno all'interno del pipetto.Ruota delicatamente quel pipetto durante il lavaggio. Prendi un secondo pipetto di cloroformio e fai la stessa cosa all'esterno del pipetto. Assicurarsi che tutto il cloroformio corra lungo il pipetto e nel flaconcino di estrazione.Quando hai finito con la pipetta lunga, prendi quella corta e ripeti, ma lavala nel flaconcino con il campione. Individuazione di un campione. Pulire una siringa con cloroformio.Prendere un campione di volume noto e risciacquare la siringa nel campione. Tirare il campione oltre la quantità che si desidera individuare. Quindi portare lo stantuffo alla quantità desiderata assicurandosi che non ci siano bolle d'aria.Utilizzare il pulsante per erogare 0,5 microlitri e toccare la goccia sull'asta. Lasciare asciugare prima di posizionare la goccia successiva nello stesso punto. Individua tutti i campioni in una linea su aste tenute sopra l'estremità di una piastra calda calda.Messa a fuoco in acetone. La messa a fuoco del campione avviene al 100% in acetone. Aggiungere circa 70 ml di acetone sul fondo del serbatoio di sviluppo.Prendi i due rack e abbassali delicatamente nel serbatoio di sviluppo. Guarda il fronte del solvente mentre si arrampica sull'asta fino a quando il fondo del punto si fonde con la parte superiore del punto. Rimuovere le aste.Asciugarli per circa cinque secondi, quindi ripetere la procedura. Se i campioni sono molto concentrati, questa messa a fuoco può essere eseguita una terza volta. Primo sistema di sviluppo.Il primo sistema di sviluppo è costituito da esano, etere etilico e acido formico da 98,5 a uno a 0,5. Iniziare risciacquando un cilindro graduato tre volte con esano e scartando. Riempire il cilindro graduato poco più di 85 ml con esano.Quindi utilizzare un pipetto e la bottiglia di esano per riempire il cilindro graduato a 90 ml. Quindi portare il fondo del menisco alla linea da 91 ml usando l'etere etilico, che darà un ml di etere etilico. Aggiungere 0,5 ml di acido formico usando la siringa Hamilton.Ma prima risciacquare la siringa hamilton tre volte con l'acido formico per assicurarsi che non rimanga alcun cloroformio utilizzato per risciacquare il campione dalla siringa. Aggiungere due siringhe complete o 25 microlitri alla volta per un totale di 50 microlitri. È importante che l'acido formico venga risciacquato immediatamente dalla siringa con cloroformio per evitare di corrodere il metallo nella siringa.Una volta che la siringa Hamilton è pulita, preparare la soluzione fino a esattamente 100 ml usando esano e un pipetto. Quindi tappare e invertire tre o quattro volte. Versare circa 30 ml nel serbatoio di sviluppo.Utilizzare questi 30 ml per bagnare la carta e risciacquare il serbatoio. Eliminare la soluzione di risciacquo. Aggiungere i restanti 70 ml al serbatoio di sviluppo.Aggiunta di rack al sistema di sviluppo. L'aggiunta di aste al sistema di sviluppo è la stessa per ogni sviluppo. Assicurarsi che il timer sia impostato per il tempo in cui le aste devono essere sviluppate.E poi prendi i rack e abbassali delicatamente nel serbatoio. Guardare fino a quando il fronte del solvente raggiunge i punti del campione, quindi avviare il timer. Secondo sistema di sviluppo.Il secondo sistema di sviluppo è l'esano, l'etilene e l'acido formico, da 79 a 20 a uno. Quindi, come prima, risciacquare il cilindro graduato tre volte con esano. Aggiungere esattamente 20 ml di etere e poi un ml di acido formico, che porta il volume a 21 ml.Quindi portare il volume a 100 ml con esano. Aggiungere circa 75 ml di esano usando le pompe del flacone. E per la porzione, usa un pipetto.Cappuccio e inversione più volte. Aggiungere circa 30 ml al serbatoio di sviluppo per bagnare la carta e risciacquare il serbatoio. Scartare i 30 ml.Aggiungi i restanti 70 ed è pronto per il set di aste. Terzo sistema di sviluppo. Il terzo sistema di sviluppo è una miscela di cloroformio, metanolo e acqua estratta dal cloroformio, da 50, 40 a 10.Risciacquare il cilindro graduato tre volte con cloroformio. Aggiungere circa 45 ml di cloroformio. Usando una pipetta, portare il fondo del menisco al segno di 50 ml.Aggiungere circa 38 ml di metanolo. Portare il fondo del menisco alla linea da 90 ml. Quindi riempire gli ultimi 10 ml con acqua estratta dal cloroformio.Come con gli altri sistemi di sviluppo, invertire questo tre o quattro volte, quindi versare 30 ml nel serbatoio per bagnare la carta. Scartare quei 30 ml e aggiungere gli ultimi 70 ml nel serbatoio. Preparazione del metanolo.Per preparare la soluzione di Hilditch utilizzata per la derivatizzazione, riempire un pallone volumetrico pulito dai lipidi che è stato anche essiccato o risciacquato altre tre volte con metanolo per rimuovere qualsiasi cloroformio. Aggiungere metanolo fino a quando il fondo del menisco è alla linea di contenimento. Dopo aver misurato il metanolo, aggiungere solfato di sodio che è stato essiccato per almeno 24 ore a 60 gradi Celsius.Aggiungere abbastanza solfato di sodio in modo che copra il fondo del pallone metrico del volume. Una volta coperto, invertire due volte in modo che l'acqua che si trova nel metanolo venga assorbita dal solfato di sodio. Dopo aver invertito e agitato, lasciare riposare per almeno cinque minuti.Aggiungendo l'acido. Dopo che il metanolo si è depositato per cinque minuti, decantarlo lentamente nella bottiglia di vetro finale assicurandosi che tutto il solfato di sodio rimanga sul fondo del pallone volumetrico. Il solfato di sodio di solito rimane sul fondo, quindi tutto il metanolo dovrebbe fuoriuscire.Lasciare asciugare il volumetrico con il solfato di sodio nella parte posteriore della cappa aspirante. Aggiungere lentamente acido solforico al metanolo usando un PIPETMAN. Aggiungere poche gocce alla volta in modo che il metanolo non sputi.Una volta aggiunto tutto l'acido, tappare e mescolare delicatamente per mescolare. La soluzione è ora pronta per essere utilizzata per i derivati, ma deve essere costituita su base settimanale. Fare i derivati.Da una fiala di estratto che ha avuto il volume portato a una quantità nota, ruotare, quindi rimuovere una parte dell'estratto in un flaconcino da 15 ml pulito e privo di lipidi. La quantità che si rimuove sarà determinata dalla concentrazione del campione da Iatroscan. Utilizzare un pipetto Drummond lipopolia per rimuovere il campione.Una volta rimosso il campione, posizionare il flaconcino da 15 ml sotto azoto per far evaporare completamente il cloroformio. Il campione originale può essere conservato e restituito al congelatore. Quando il campione viene essiccato, aggiungere 1,5 ml di diclorometano o un pipetful e tre ml della soluzione di Hilditch che è stata composta in precedenza quel giorno o due pipetfuls.Questa soluzione viene quindi mantenuta sotto azoto, vorticosa e posta nel sonicatore per quattro minuti prima di essere posta in un forno a 100 gradi Celsius per un'ora. Fermare la reazione. Dopo il riscaldamento a 100 gradi Celsius per un'ora e il raffreddamento, aggiungere lentamente 0,5 ml di soluzione satura di bicarbonato di sodio.Le bolle saranno prodotte quando l'acido viene neutralizzato. Quindi aggiungere 1,5 ml di esano. Ricapitolando e agitare vigorosamente.Lascialo stare in modo che si separi in due strati. Elaborare tutti i campioni. Quando saranno tutti finiti, il primo sarà pronto per il passaggio successivo.Rimozione del livello superiore. Una volta che la derivatizzazione è stata interrotta e c'è una chiara separazione nel flaconcino da 15 ml, rimuovere lo strato superiore e metterlo in un flaconcino da due ml pulito dai lipidi. È meglio lasciare un po 'dello strato superiore piuttosto che ottenere uno qualsiasi degli strati inferiori nella fiala da due ml.Una volta rimossa la maggior parte dello strato superiore, il resto della soluzione può essere scartato. L'estratto che si trova nei due ml deve essere evaporato completamente sotto un delicato flusso di azoto. Una volta che la fiala è completamente asciutta, l'esano può essere riaggiunto, quindi il campione deve essere sonicato, tenuto sotto azoto, e quindi è pronto per andare al GC. Risultati rappresentativi.Questa figura mostra i cromatogrammi TLC-FIC grezzi del nostro standard, una dieta a base di olio di colza e tessuto epatico da un salmone alimentato con quella dieta. L'acquacoltura, il settore della produzione alimentare in più rapida crescita, deve ridurre la sua dipendenza dalla farina di pesce e dall'olio di pesce di origine selvatica. Gli oli vegetali sono in fase di studio come sostituti dell'olio di pesce negli aquafeed.E il fegato, il sito primario per il metabolismo dei lipidi, è mirato per l'analisi. Possiamo vedere la prevalenza di triacilgliceroli nella dieta nel fegato e anche l'importanza dei fosfolipidi di membrana nel fegato. Questa figura mostra i cromatogrammi di uno standard.Lipidi e particelle di sedimentazione raccolti al largo della costa qui e lipidi nel misid raccolti vicino alla stessa profondità. Qui, i cromatogrammi sono stati elaborati attraverso software di plottaggio. Essendo ricchi di carbonio con un valore energetico molto elevato, i lipidi sono una componente importante della produttività delle aree degli scaffali, che sono particolarmente importanti per il ciclo del carbonio.Più produzione primaria di superficie raggiunge il fondo marino in acque meno profonde. Abbiamo scoperto che il piccolo mysid aveva la più alta concentrazione di lipidi nei nostri campioni. Cera ed esteri sterili sono combinati qui.E c'è un picco di scissione a causa della presenza di alti livelli di acidi grassi polinsaturi. La rapidità con cui il sistema Chromarod Iatroscan TLC-FID fornisce dati sinottici sulla classe lipidica da piccoli campioni lo rende un potente strumento per lo screening di campioni marini prima di eseguire analisi cromatografiche più dettagliate. Tali analisi di solito richiedono il rilascio di composti componenti da estratti lipidici e la derivatizzazione per aumentare la volatilità.

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