فحص الأدوية القائم على النسخ الفعال من حيث التكلفة

Summary

يصف هذا البروتوكول سير العمل من مزارع الخلايا خارج الجسم الحي أو في المختبر إلى المعالجة المسبقة للبيانات النسخية لفحص الأدوية القائم على النسخ الفعال من حيث التكلفة.

Abstract

يسمح Transcriptomics بالحصول على رؤى شاملة حول البرامج الخلوية واستجاباتها للاضطرابات. على الرغم من الانخفاض الكبير في تكاليف إنتاج المكتبات وتسلسلها في العقد الماضي ، فإن تطبيق هذه التقنيات على النطاق اللازم لفحص المخدرات لا يزال مكلفا للغاية ، مما يعيق الإمكانات الهائلة لهذه الأساليب. تقدم دراستنا نظاما فعالا من حيث التكلفة لفحص الأدوية القائم على النسخ ، ويجمع بين ثقافات الاضطراب المصغرة والنسخ السائبة الصغيرة. يوفر بروتوكول السائبة الصغيرة المحسن إشارات بيولوجية إعلامية على عمق تسلسل فعال من حيث التكلفة ، مما يتيح فحصا مكثفا للأدوية المعروفة والجزيئات الجديدة. اعتمادا على العلاج المختار ووقت الحضانة ، سيؤدي هذا البروتوكول إلى تسلسل المكتبات في غضون أيام 2 تقريبا. نظرا للعديد من نقاط التوقف داخل هذا البروتوكول ، يمكن إجراء إعداد المكتبة ، وكذلك التسلسل ، بشكل مستقل عن الوقت. معالجة عدد كبير من العينات في وقت واحد ممكن ؛ تم اختبار قياس ما يصل إلى 384 عينة دون فقدان جودة البيانات. لا توجد أيضا قيود معروفة على عدد الحالات و / أو الأدوية ، على الرغم من مراعاة التباين في أوقات حضانة الدواء المثلى.

Introduction

يعد تطوير عقاقير جديدة عملية معقدة وتستغرق وقتا طويلا وتتضمن تحديد الأدوية المحتملة وأهدافها ، وتحسين وتوليف الأدوية المرشحة ، واختبار فعاليتها وسلامتها في التجارب قبل السريرية والسريرية¹. تتضمن الطرق التقليدية لفحص الأدوية ، أي التقييم المنهجي لمكتبات المركبات المرشحة للأغراض العلاجية ، استخدام نماذج حيوانية أو مقايسات قائمة على الخلايا لاختبار التأثيرات على أهداف أو مسارات محددة. في حين أن هذه الطرق كانت ناجحة في تحديد الأدوية المرشحة ، إلا أنها في كثير من الأحيان لم تقدم رؤى كافية حول الآليات الجزيئية المعقدة الكامنة وراء فعالية الدواء وكذلك السمية وآليات الآثار الجانبية المحتملة.

يقدم تقييم حالات النسخ على مستوى ....

Protocol

يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية للجان الأخلاقيات المحلية في جامعة بون.

1. إعداد المخازن المؤقتة والحلول والمعدات

1. إعداد الحلول وجمع المواد الموضحة في جدول المواد.
2. قم بتسخين الحمام المائي إلى 37 درجة مئوية وقم بتسخين وسط النمو الكامل (RPMI-1640 + 10٪ مصل عجل الجنين (FCS) + 1٪ بنسلين / ستربتومايسين).
3. لحصاد الخلايا ، استخدم محلول ملحي مخزن بالفوسفات المثلج (PBS).
   ملاحظة: حافظ على بيئة نظيفة أثناء العمل مع الخلايا للحفاظ على العقم.

2. التعامل مع الخلايا

ملاحظة: يمكن العثور على بروتوكول مفصل للحفظ ب....

النتائج

باتباع البروتوكول المبلغ عنه ، تم زرع PBMCs البشرية ، ومعالجتها بأدوية مناعية مختلفة ، وبعد أوقات حضانة مختلفة ، تم حصادها لتحليل النسخ السائب باستخدام بروتوكول التسلسل (الشكل 1).

يجب تحديد تركيزات الدواء المثالية وأوقات الحضانة لمركبات الاختبار قبل هذا البرو.......

Discussion

يمكن أن يستفيد اكتشاف الأدوية وتطوير الأدوية بشكل كبير من النظرة الشاملة للعمليات الخلوية التي يمكن أن توفرها النسخ السائبة. ومع ذلك ، غالبا ما يكون هذا النهج محدودا بسبب التكلفة العالية للتجربة مع بروتوكول RNA-seq القياسي السائب ، مما يحظر تطبيقه في البيئات الأكاديمية بالإضافة إلى إمكانية .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL conical tube	fisher scientific	10203001
Adhesive PCR Plate Seals	Thermo Fisher Scientific	AB0558
Amplicon Tagment Mix (ATM)	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A 63881
Betaine	Sigma-Aldrich	61962
Cell culture grade 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	260860
Cell culture vacuum pump (VACUSAFE)	Integra Bioscience	158300
Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each	Fermentas	R0192
DMSO	Sigma-Aldrich	276855
DTT (100 mM)	Invitrogen	18064-014
EDTA	Sigma-Aldrich	798681	for adherent cells
Ethanol	Sigma-Aldrich	51976
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	26140079
Filter tips (10 µL)	Gilson	F171203
Filter tips (100 µL)	Gilson	F171403
Filter tips (20 µL)	Gilson	F171303
Filter tips (200 µL)	Gilson	F171503
Guanidine Hydrochloride	Sigma-Aldrich	G3272
ISPCR primer (10 µM)	Biomers.net GmbH	SP10006	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)	KAPA Biosystems	KK2601
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Magnetic stand 96	Ambion	AM10027
Neutralize Tagment (NT) Buffer	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS
Nextera-compatible indexing primer	Illumina
Nuclease-free water	Invitrogen	10977049
PBS	Thermo Fisher Scientific	AM9624
PCR 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	AB0600
PCR plate sealer	Thermo Fisher Scientific	HSF0031
Penicillin / Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15070063
Qubit 4 fluorometer	Invitrogen	15723679
Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul)	TAKARA	2313A
RPMI-1640 cell culture medium	Gibco	61870036	If not working with PBMCs, adjust to cell type
SMART dT30VN primer	Sigma-Aldrich		5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3
Standard lab equipment	various	various	e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II)	Thermo Fisher Scientific	18064-014
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x)	Thermo Fisher Scientific	18064-014
Tagment DNA Buffer (TD)	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
TapeStation system 4200	Agilent	G2991BA
Thermocycler (S1000)	Bio-Rad	1852148
TSO-LNA (100 uM)	Eurogentec		5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G
Vortex-Genie 2 Mixer	Sigma-Aldrich	Z258415