Cribado de fármacos basado en transcriptómica rentable

Resumen

Este protocolo describe un flujo de trabajo desde los cultivos celulares ex vivo o in vitro hasta el preprocesamiento de datos transcriptómicos para el cribado rentable de fármacos basado en transcriptomas.

Resumen

La transcriptómica permite obtener información completa sobre los programas celulares y sus respuestas a las perturbaciones. A pesar de una disminución significativa en los costos de producción y secuenciación de bibliotecas en la última década, la aplicación de estas tecnologías a la escala necesaria para el cribado de drogas sigue siendo prohibitivamente costosa, lo que obstruye el inmenso potencial de estos métodos. Nuestro estudio presenta un sistema rentable para el cribado de fármacos basado en transcriptomas, que combina cultivos de perturbaciones miniaturizados con transcriptómica minimasiva. El protocolo minimasivo optimizado proporciona señales biológicas informativas a una profundidad de secuenciación rentable, lo que permite un cribado exhaustivo de fármacos conocidos y nuevas moléculas. Dependiendo del tratamiento elegido y del tiempo de incubación, este protocolo dará como resultado la secuenciación de las bibliotecas en aproximadamente 2 días. Debido a varios puntos de parada dentro de este protocolo, la preparación de la biblioteca, así como la secuenciación, se pueden realizar independientemente del tiempo. Es posible procesar simultáneamente un gran número de muestras; Se probó la medición de hasta 384 muestras sin pérdida de calidad de los datos. Tampoco se conocen limitaciones en cuanto al número de afecciones y/o fármacos, a pesar de tener en cuenta la variabilidad en los tiempos óptimos de incubación de fármacos.

Introducción

El desarrollo de nuevos fármacos es un proceso complejo y lento que implica la identificación de fármacos potenciales y sus dianas, la optimización y síntesis de candidatos a fármacos, y la comprobación de su eficacia y seguridad en ensayos preclínicos y clínicos¹. Los métodos tradicionales para el cribado de fármacos, es decir, la evaluación sistemática de bibliotecas de compuestos candidatos con fines terapéuticos, implican el uso de modelos animales o ensayos basados en células para probar los efectos sobre dianas o vías específicas. Si bien estos métodos han tenido éxito en la identificación de candidatos a fármacos, a menudo no proporciona....

Protocolo

Este protocolo sigue las directrices de los comités locales de ética de la Universidad de Bonn.

1. Preparación de tampones, soluciones y equipos

1. Prepare las soluciones y reúna los materiales descritos en la Tabla de materiales.
2. Calentar el baño de agua a 37 °C y calentar todo el medio de cultivo (RPMI-1640 + 10% de suero fetal de ternero (FCS) + 1% de penicilina/estreptomicina).
3. Para la recolección de células, use solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada.
   NOTA: Mantenga un ambiente limpio mientras trabaja con las células para mantener la esterilidad.

Discusión

El descubrimiento y el desarrollo de fármacos pueden beneficiarse enormemente de la visión holística de los procesos celulares que puede proporcionar la transcriptómica masiva. Sin embargo, este enfoque a menudo se ve limitado por el alto costo del experimento con el protocolo estándar de secuenciación de ARN a granel, lo que prohíbe su aplicación en entornos académicos, así como su potencial de escalabilidad industrial.

Los pasos más críticos del protocolo son la descongelación c.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL conical tube	fisher scientific	10203001
Adhesive PCR Plate Seals	Thermo Fisher Scientific	AB0558
Amplicon Tagment Mix (ATM)	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A 63881
Betaine	Sigma-Aldrich	61962
Cell culture grade 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	260860
Cell culture vacuum pump (VACUSAFE)	Integra Bioscience	158300
Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each	Fermentas	R0192
DMSO	Sigma-Aldrich	276855
DTT (100 mM)	Invitrogen	18064-014
EDTA	Sigma-Aldrich	798681	for adherent cells
Ethanol	Sigma-Aldrich	51976
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	26140079
Filter tips (10 µL)	Gilson	F171203
Filter tips (100 µL)	Gilson	F171403
Filter tips (20 µL)	Gilson	F171303
Filter tips (200 µL)	Gilson	F171503
Guanidine Hydrochloride	Sigma-Aldrich	G3272
ISPCR primer (10 µM)	Biomers.net GmbH	SP10006	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)	KAPA Biosystems	KK2601
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Magnetic stand 96	Ambion	AM10027
Neutralize Tagment (NT) Buffer	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS
Nextera-compatible indexing primer	Illumina
Nuclease-free water	Invitrogen	10977049
PBS	Thermo Fisher Scientific	AM9624
PCR 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	AB0600
PCR plate sealer	Thermo Fisher Scientific	HSF0031
Penicillin / Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15070063
Qubit 4 fluorometer	Invitrogen	15723679
Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul)	TAKARA	2313A
RPMI-1640 cell culture medium	Gibco	61870036	If not working with PBMCs, adjust to cell type
SMART dT30VN primer	Sigma-Aldrich		5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3
Standard lab equipment	various	various	e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II)	Thermo Fisher Scientific	18064-014
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x)	Thermo Fisher Scientific	18064-014
Tagment DNA Buffer (TD)	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
TapeStation system 4200	Agilent	G2991BA
Thermocycler (S1000)	Bio-Rad	1852148
TSO-LNA (100 uM)	Eurogentec		5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G
Vortex-Genie 2 Mixer	Sigma-Aldrich	Z258415