Triagem Transcriptomic-Based Drug Screening Custo-Eficiente

Resumo

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho de culturas de células ex vivo ou in vitro para pré-processamento de dados transcriptômicos para triagem de drogas baseada em transcriptoma custo-efetivo.

Resumo

A transcriptômica permite obter informações abrangentes sobre programas celulares e suas respostas a perturbações. Apesar da diminuição significativa dos custos de produção e sequenciamento das bibliotecas na última década, a aplicação dessas tecnologias na escala necessária para a triagem de drogas continua sendo proibitivamente cara, obstruindo o imenso potencial desses métodos. Nosso estudo apresenta um sistema custo-efetivo para triagem de drogas baseada em transcriptomas, combinando culturas de perturbação miniaturizadas com transcriptômica mini-massil. O protocolo otimizado de mini-bulk fornece sinais biológicos informativos em profundidade de sequenciamento econômica, permitindo uma extensa triagem de drogas conhecidas e novas moléculas. Dependendo do tratamento escolhido e do tempo de incubação, este protocolo resultará em bibliotecas de sequenciamento dentro de aproximadamente 2 dias. Devido a vários pontos de parada dentro deste protocolo, a preparação da biblioteca, bem como o sequenciamento, pode ser realizado de forma independente do tempo. É possível processar simultaneamente um número elevado de amostras; A medição de até 384 amostras foi testada sem perda da qualidade dos dados. Também não há limitações conhecidas para o número de condições e/ou drogas, apesar de considerar a variabilidade nos tempos ideais de incubação dos fármacos.

Introdução

O desenvolvimento de novos fármacos é um processo complexo e demorado que envolve a identificação de potenciais fármacos e seus alvos, a otimização e síntese de candidatos a fármacos e o teste de sua eficácia e segurança em ensaios pré-clínicos e clínicos¹. Os métodos tradicionais de triagem de drogas, ou seja, a avaliação sistemática de bibliotecas de compostos candidatos para fins terapêuticos, envolvem o uso de modelos animais ou ensaios baseados em células para testar os efeitos em alvos ou vias específicas. Embora esses métodos tenham sido bem-sucedidos na identificação de candidatos a drogas, eles muitas vezes não forneceram informações s....

Protocolo

Este protocolo segue as diretrizes dos comitês de ética locais da Universidade de Bonn.

1. Preparação de tampões, soluções e equipamentos

1. Preparar as soluções e reunir os materiais descritos na Tabela de Materiais.
2. Aquecer o banho-maria a 37 °C e aquecer o meio de crescimento completo (RPMI-1640 + 10% de soro fetal de bezerro (SFB) + 1% de penicilina/estreptomicina).
3. Para a colheita celular, use solução salina tamponada com fosfato (PBS) gelada.
   NOTA: Mantenha um ambiente limpo enquanto trabalha com células para manter a esterilidade.

....

Discussão

A descoberta de drogas e o desenvolvimento de drogas podem se beneficiar muito da visão holística dos processos celulares que a transcriptômica em massa pode fornecer. No entanto, essa abordagem é frequentemente limitada pelo alto custo do experimento com o protocolo RNA-seq a granel padrão, proibindo sua aplicação em ambientes acadêmicos, bem como seu potencial para escalabilidade industrial.

As etapas mais críticas do protocolo são o descongelamento celular e as etapas iniciais da .......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL conical tube	fisher scientific	10203001
Adhesive PCR Plate Seals	Thermo Fisher Scientific	AB0558
Amplicon Tagment Mix (ATM)	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A 63881
Betaine	Sigma-Aldrich	61962
Cell culture grade 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	260860
Cell culture vacuum pump (VACUSAFE)	Integra Bioscience	158300
Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each	Fermentas	R0192
DMSO	Sigma-Aldrich	276855
DTT (100 mM)	Invitrogen	18064-014
EDTA	Sigma-Aldrich	798681	for adherent cells
Ethanol	Sigma-Aldrich	51976
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	26140079
Filter tips (10 µL)	Gilson	F171203
Filter tips (100 µL)	Gilson	F171403
Filter tips (20 µL)	Gilson	F171303
Filter tips (200 µL)	Gilson	F171503
Guanidine Hydrochloride	Sigma-Aldrich	G3272
ISPCR primer (10 µM)	Biomers.net GmbH	SP10006	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)	KAPA Biosystems	KK2601
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Magnetic stand 96	Ambion	AM10027
Neutralize Tagment (NT) Buffer	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS
Nextera-compatible indexing primer	Illumina
Nuclease-free water	Invitrogen	10977049
PBS	Thermo Fisher Scientific	AM9624
PCR 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	AB0600
PCR plate sealer	Thermo Fisher Scientific	HSF0031
Penicillin / Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15070063
Qubit 4 fluorometer	Invitrogen	15723679
Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul)	TAKARA	2313A
RPMI-1640 cell culture medium	Gibco	61870036	If not working with PBMCs, adjust to cell type
SMART dT30VN primer	Sigma-Aldrich		5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3
Standard lab equipment	various	various	e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II)	Thermo Fisher Scientific	18064-014
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x)	Thermo Fisher Scientific	18064-014
Tagment DNA Buffer (TD)	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
TapeStation system 4200	Agilent	G2991BA
Thermocycler (S1000)	Bio-Rad	1852148
TSO-LNA (100 uM)	Eurogentec		5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G
Vortex-Genie 2 Mixer	Sigma-Aldrich	Z258415