基于转录组学的经济高效的药物筛选

摘要

该协议描述了从 离体 或 体外 细胞培养到转录组数据预处理的工作流程，以实现具有成本效益的基于转录组的药物筛选。

摘要

转录组学可以全面了解细胞程序及其对扰动的反应。尽管在过去十年中，文库生产和测序的成本显著降低，但以药物筛选所需的规模应用这些技术仍然非常昂贵，阻碍了这些方法的巨大潜力。我们的研究提出了一种具有成本效益的基于转录组的药物筛选系统，将小型扰动培养物与小型批量转录组学相结合。优化的小型批量实验方案以经济高效的测序深度提供信息丰富的生物信号，从而能够对已知药物和新分子进行广泛筛选。根据所选的处理和孵育时间，该方案将在大约 2 天内产生测序文库。由于该协议中有多个停止点，因此文库制备和测序可以不受时间限制地进行。可以同时处理大量样品;对多达 384 个样品的测量进行了测试，而不会降低数据质量。尽管考虑了最佳药物孵育时间的可变性，但对条件和/或药物的数量也没有已知的限制。

引言

新药开发是一个复杂且耗时的过程，涉及识别潜在药物及其靶点、优化和合成候选药物，以及在临床前和临床试验中测试其有效性和安全性¹。传统的药物筛选方法，即用于治疗目的的候选化合物库的系统评估，涉及使用动物模型或基于细胞的测定来测试对特定靶标或通路的影响。虽然这些方法在识别候选药物方面取得了成功，但它们往往不能对药物疗效背后的复杂分子机制以及潜在副作用的毒性和机制提供足够的见解。

评估全基因组转录状态是克服当前药物筛选局限性的有力方法，因为它可以全面评估响应药物治疗的基因表达²。通过以全基因组方式测量在给定时间表达的 RNA 转录本，转录组学旨在提供响应药物时发生的转录变化的整体视图，包括基因表达模式、选择性剪接和非编码 RNA 表达的变化³。这些信息可用于确定药物靶点，预测药物疗效和毒性，并优化药物剂量和治疗方案。

将转录组学与无偏倚药物筛选相结合的主要好处之一是有可能识别以前未考虑过的新药物靶点。传统的药物筛选方法通常侧重于已建立的靶点分子或通路，阻碍了新靶点的识别，并可能导致药物具有不可预见的副作用和有限的有效性。转录组学可以通过深入了解药物治疗后发生的分子变化来克服这些局限性，发现以前可能未考虑过的潜在靶点或途径².

研究方案

该协议遵循波恩大学当地伦理委员会的指导方针。

1. 缓冲液、溶液和设备的制备

1. 准备解决方案并收集 材料表中描述的材料。
2. 将水浴加热至37°C，并加热完整的生长培养基（RPMI-1640 + 10%胎牛血清（FCS）+ 1%青霉素/链霉素）。
3. 对于细胞收获，使用冰冷的磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。
   注意：在使用细胞时保持清洁环境以保持无菌。

2. 细胞处理

注意：从人血中冷冻保存外周血单核细胞 （PBMC） 的详细方案可在⁷ 中找到。

1. 细胞解冻和计数
   1. 从液氮中取出冷冻管，并在37°C的水浴中解冻2-3分钟，同时轻轻倒置。
   2. 将解冻的细胞转移到 50 mL 锥形管中。
   3. 用 1 mL 温热的完全生长培养基冲洗冷冻管，并将该溶液滴加到管中的细胞中（^{第 1 个} 稀释步骤）。
   4. 以 1：1 重复稀释，直至达到 32 mL 的体积（总共 5 次稀释，分别使用 1、2、4、8 和 16 mL 温热的完全生长培养基）。滴加培养基以减少细胞干扰，同....

讨论

药物发现和药物开发可以从批量转录组学提供的细胞过程的整体视图中受益匪浅。然而，这种方法往往受到标准批量RNA-seq实验方案的高成本的限制，阻碍了其在学术环境中的应用以及其工业可扩展性的潜力。

该方案最关键的步骤是细胞解冻和文库制备的初始步骤。确保解冻后细胞的高活力对于成功的治疗和转录组学分析至关重要。细胞收获和文库制备的第一步，直到cDNA合成.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL conical tube	fisher scientific	10203001
Adhesive PCR Plate Seals	Thermo Fisher Scientific	AB0558
Amplicon Tagment Mix (ATM)	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A 63881
Betaine	Sigma-Aldrich	61962
Cell culture grade 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	260860
Cell culture vacuum pump (VACUSAFE)	Integra Bioscience	158300
Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each	Fermentas	R0192
DMSO	Sigma-Aldrich	276855
DTT (100 mM)	Invitrogen	18064-014
EDTA	Sigma-Aldrich	798681	for adherent cells
Ethanol	Sigma-Aldrich	51976
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	26140079
Filter tips (10 µL)	Gilson	F171203
Filter tips (100 µL)	Gilson	F171403
Filter tips (20 µL)	Gilson	F171303
Filter tips (200 µL)	Gilson	F171503
Guanidine Hydrochloride	Sigma-Aldrich	G3272
ISPCR primer (10 µM)	Biomers.net GmbH	SP10006	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)	KAPA Biosystems	KK2601
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Magnetic stand 96	Ambion	AM10027
Neutralize Tagment (NT) Buffer	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS
Nextera-compatible indexing primer	Illumina
Nuclease-free water	Invitrogen	10977049
PBS	Thermo Fisher Scientific	AM9624
PCR 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	AB0600
PCR plate sealer	Thermo Fisher Scientific	HSF0031
Penicillin / Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15070063
Qubit 4 fluorometer	Invitrogen	15723679
Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul)	TAKARA	2313A
RPMI-1640 cell culture medium	Gibco	61870036	If not working with PBMCs, adjust to cell type
SMART dT30VN primer	Sigma-Aldrich		5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3
Standard lab equipment	various	various	e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II)	Thermo Fisher Scientific	18064-014
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x)	Thermo Fisher Scientific	18064-014
Tagment DNA Buffer (TD)	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
TapeStation system 4200	Agilent	G2991BA
Thermocycler (S1000)	Bio-Rad	1852148
TSO-LNA (100 uM)	Eurogentec		5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G
Vortex-Genie 2 Mixer	Sigma-Aldrich	Z258415