Screening farmacologico basato sulla trascrittomica efficiente in termini di costi

Riepilogo

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro che va dalle colture cellulari ex vivo o in vitro alla pre-elaborazione dei dati trascrittomici per uno screening farmacologico basato sul trascrittoma economicamente vantaggioso.

Abstract

La trascrittomica consente di ottenere informazioni complete sui programmi cellulari e sulle loro risposte alle perturbazioni. Nonostante una significativa diminuzione dei costi di produzione e sequenziamento delle librerie nell'ultimo decennio, l'applicazione di queste tecnologie alla scala necessaria per lo screening dei farmaci rimane proibitivamente costosa, ostacolando l'immenso potenziale di questi metodi. Il nostro studio presenta un sistema economicamente vantaggioso per lo screening farmacologico basato sul trascrittoma, che combina colture di perturbazione miniaturizzate con trascrittomica mini-bulk. Il protocollo mini-bulk ottimizzato fornisce segnali biologici informativi a una profondità di sequenziamento conveniente, consentendo uno screening approfondito di farmaci noti e nuove molecole. A seconda del trattamento scelto e del tempo di incubazione, questo protocollo si tradurrà in librerie di sequenziamento entro circa 2 giorni. A causa dei diversi punti di arresto all'interno di questo protocollo, la preparazione della libreria, così come il sequenziamento, possono essere eseguiti indipendentemente dal tempo. È possibile processare contemporaneamente un numero elevato di campioni; La misurazione di un massimo di 384 campioni è stata testata senza perdita di qualità dei dati. Inoltre, non sono note limitazioni al numero di condizioni e/o farmaci, nonostante si consideri la variabilità nei tempi ottimali di incubazione dei farmaci.

Introduzione

Lo sviluppo di nuovi farmaci è un processo complesso e dispendioso in termini di tempo che comporta l'identificazione di potenziali farmaci e dei loro bersagli, l'ottimizzazione e la sintesi di farmaci candidati e la verifica della loro efficacia e sicurezza in studi preclinici e clinici¹. I metodi tradizionali per lo screening dei farmaci, cioè la valutazione sistematica di librerie di composti candidati per scopi terapeutici, prevedono l'uso di modelli animali o saggi basati su cellule per testare gli effetti su bersagli o percorsi specifici. Sebbene questi metodi abbiano avuto successo nell'identificare i farmaci candidati, spesso non hanno ....

Protocollo

Questo protocollo segue le linee guida dei comitati etici locali dell'Università di Bonn.

1. Preparazione di tamponi, soluzioni e attrezzature

1. Preparare le soluzioni e raccogliere i materiali descritti nell'Indice dei materiali.
2. Riscaldare il bagnomaria a 37 °C e riscaldare il terreno di coltura completo (RPMI-1640 + 10% siero fetale di vitello (FCS) + 1% penicillina/streptomicina).
3. Per la raccolta delle cellule, utilizzare soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (PBS).
   NOTA: Mantenere un ambiente pulito mentre si lavora con le cellule per mantenere la sterilità.

Discussione

La scoperta e lo sviluppo di farmaci possono trarre grandi benefici dalla visione olistica dei processi cellulari che la trascrittomica di massa può fornire. Tuttavia, questo approccio è spesso limitato dall'alto costo dell'esperimento con il protocollo standard di RNA-seq di massa, che ne impedisce l'applicazione in ambienti accademici e dal suo potenziale di scalabilità industriale.

Le fasi più critiche del protocollo sono lo scongelamento delle cellule e le fasi iniziali della preparazi.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL conical tube	fisher scientific	10203001
Adhesive PCR Plate Seals	Thermo Fisher Scientific	AB0558
Amplicon Tagment Mix (ATM)	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A 63881
Betaine	Sigma-Aldrich	61962
Cell culture grade 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	260860
Cell culture vacuum pump (VACUSAFE)	Integra Bioscience	158300
Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each	Fermentas	R0192
DMSO	Sigma-Aldrich	276855
DTT (100 mM)	Invitrogen	18064-014
EDTA	Sigma-Aldrich	798681	for adherent cells
Ethanol	Sigma-Aldrich	51976
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	26140079
Filter tips (10 µL)	Gilson	F171203
Filter tips (100 µL)	Gilson	F171403
Filter tips (20 µL)	Gilson	F171303
Filter tips (200 µL)	Gilson	F171503
Guanidine Hydrochloride	Sigma-Aldrich	G3272
ISPCR primer (10 µM)	Biomers.net GmbH	SP10006	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)	KAPA Biosystems	KK2601
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Magnetic stand 96	Ambion	AM10027
Neutralize Tagment (NT) Buffer	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS
Nextera-compatible indexing primer	Illumina
Nuclease-free water	Invitrogen	10977049
PBS	Thermo Fisher Scientific	AM9624
PCR 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	AB0600
PCR plate sealer	Thermo Fisher Scientific	HSF0031
Penicillin / Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15070063
Qubit 4 fluorometer	Invitrogen	15723679
Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul)	TAKARA	2313A
RPMI-1640 cell culture medium	Gibco	61870036	If not working with PBMCs, adjust to cell type
SMART dT30VN primer	Sigma-Aldrich		5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3
Standard lab equipment	various	various	e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II)	Thermo Fisher Scientific	18064-014
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x)	Thermo Fisher Scientific	18064-014
Tagment DNA Buffer (TD)	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
TapeStation system 4200	Agilent	G2991BA
Thermocycler (S1000)	Bio-Rad	1852148
TSO-LNA (100 uM)	Eurogentec		5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G
Vortex-Genie 2 Mixer	Sigma-Aldrich	Z258415